Methodenartikel

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

59.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/2763

⸱

26 maart 2011

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Oncology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.

Samenvatting

Ziekte ontwikkeling en progressie worden gekenmerkt door frequente genetische en epigenetische afwijkingen waaronder chromosomale herschikkingen, aantal kopieën winsten en verliezen en DNA-methylatie. Vooruitgang in de high-throughput, genoom-brede profiling technologieën, zoals microarrays, hebben aanzienlijk verbeterd ons vermogen om te identificeren en op te sporen deze specifieke wijzigingen. Maar naarmate de technologie steeds beter, een beperkende factor blijft monster kwaliteit en beschikbaarheid. Bovendien, follow-up klinische informatie en ziekte uitkomsten worden vaak verzameld jaar na de eerste monster collectie. Monsters, zijn meestal in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE), opgeslagen in het ziekenhuis archieven voor de komende jaren decennia. DNA kan efficiënt en effectief worden verhaald op paraffine ingebedde monsters als de juiste methode van extractie wordt toegepast. Hoge kwaliteit DNA geëxtraheerd uit goed bewaard en opgeslagen monsters kunnen ondersteunen kwantitatieve bepalingen voor vergelijkingen van normale en aangetaste weefsels en genereren van genetische en epigenetische handtekeningen 1. Voor het extraheren van DNA uit paraffine-ingebed monsters weefsel kernen of gemicrodissecteerde weefsel worden onderworpen aan xyleen behandeling, die de paraffine uit het weefsel oplost, en vervolgens gerehydrateerd met behulp van een reeks van ethanol wasbeurten. Eiwitten en schadelijke enzymen zoals nucleasen worden vervolgens verteerd door proteïnase K. De toevoeging van lysis buffer, die denaturerende middelen zoals natriumdodecylsulfaat (SDS) bevat, bevordert de spijsvertering 2. Nucleïnezuren worden gezuiverd uit het weefsel lysaat met behulp van buffer-verzadigde fenol en een hoge snelheid centrifugeren, die een bifasische oplossing genereert. DNA en RNA te blijven in de bovenste waterige fase, terwijl de eiwitten, lipiden en polysachariden worden afgezonderd in de inter-en organische-fase respectievelijk. Behoud van de waterige fase en herhaalde fenol extracties genereert een schoon monster. Naar aanleiding van fenol extractie, wordt RNase A toegevoegd aan besmettelijke RNA te elimineren. Extra fenol extracties na incubatie met RNase A worden gebruikt om de resterende enzym te verwijderen. De toevoeging van natriumacetaat en isopropanol precipitaten DNA, en de hoge snelheid centrifugeren wordt gebruikt om de DNA-pellet en vergemakkelijken isopropanol verwijdering. Overtollige zouten over van neerslag uitgevoerd kunnen interfereren met de volgende enzymatische assays, maar kan worden verwijderd uit het DNA door wassen met 70% ethanol, gevolgd door centrifugatie opnieuw pellet het DNA 3. DNA wordt opnieuw gesuspendeerd in gedestilleerd water of de buffer van keuze, gekwantificeerd en opgeslagen bij -20 ° C. Gezuiverde DNA kan vervolgens worden gebruikt in downstream toepassingen die omvatten, maar zijn niet beperkt tot, PCR, array comparative genomic hybridisatie 4 (array CGH), gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie (MeDIP) en sequencing, waardoor een integratieve analyse van weefsel / tumor monsters.

Protocol

1. Procedurele notities

  • Xyleen en fenol zijn giftige chemische stoffen en moeten worden behandeld in een fumehood. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (VIB) voor gebruik.
  • Xyleen lost op bepaalde kunststoffen, polypropyleen buizen moeten worden gebruikt als ze tolereren deze verbindingen.
  • Speciale tips kunnen worden gekocht, dat bevat een interne houtskool stop. Dit voorkomt dat de xyleen uit het oplossen van een rubber componenten in de pipet. Als alternatief kan filteren tips worden gebruikt.

2. Paraffine verwijderen

  1. In een fumehood, voeg 800 ul van xyleen (VWR, CABDH6216-4) om de gemerkte buis met uw exemplaar en leg ze op een rocker met een zacht schudden gedurende 5 tot 15 minuten om de paraffine te ontbinden.
  2. Pellet het monster door het draaien bij max. snelheid (14000 rpm of 16 000 xg) in een microcentrifuge gedurende 3 minuten. Voorzichtig te trekken van de xyleen supernatant en gooi in een polypropyleen buis ontdoen in de xyleen afval. Wees voorzichtig dat u de pellet te verstoren.
  3. Herhaal de xyleen wash de stappen 1 en 2until paraffine volledig is opgelost. Dit vereist gewoonlijk twee tot drie wasbeurten, afhankelijk van de grootte van het weefselmonster. Een volledig opgelost monster zal verschijnen zacht, en soms verliest zijn structurele integriteit. De integriteit van het monster kan voorzichtig worden beoordeeld met een pipet tip.

3. Ethanol rehydratatie

  1. Voeg 800 pi van 100% ethanol (v / v) moleculaire biologie kwaliteit ethanol, vortex, dan draaien gedurende 3 minuten bij 14.000 rpm in microcentrifuge. Verwijder de ethanol supernatant, zorg dat u de pellet te verstoren.
  2. Voeg 800 ul van 70% ethanol (100% (v / v) ethanol opgelost in gedestilleerd water (dH 2 O)), vortex, en spin gedurende 3 minuten bij 14.000 rpm. Verwijder voorzichtig het supernatant ethanol.
  3. Voeg 800 ul van 50% ethanol (100% (v / v) ethanol opgelost in gedestilleerd water (dH 2 O)), vortex, en spin gedurende 5 minuten bij 14.000 rpm. Verwijder voorzichtig zoveel ethanol mogelijk door pipetteren. Wees uiterst voorzichtig van de pellet te verstoren op dit moment zo volledig gerehydrateerd weefsel zal niet pellet evenals gedroogde weefsel.
  4. Na het verwijderen van het supernatant ethanol, drogen de pellet gedurende 5 minuten, zorg dat u meer dan drogen.

4. Tissue spijsvertering

  1. Voeg 200-500 pi Lysis Buffer (formule hieronder). Resuspendeer de pellet met behulp van een pipet tip of een vortex. Extra inspanning op dit punt om volledig opnieuw te schorsen het weefsel zal resulteren in een meer volledige vertering van het monster en een beter rendement van het DNA.
  2. Incubeer monsters bij 56 ° C in een waterbad of verwarming blokkeren.
  3. Voor weefsel kernen, spike 20 ul van proteïnase K (20 mg / ml bouillon oplossing, Invitrogen, AM2548), 's morgens en' s avonds.
  4. Herhaal bovenstaande stappen voor de spijsvertering 2 tot 5 dagen totdat het weefsel volledig is opgelost.

Lysis Buffer

  • 10 mM Tris-HCl pH 8,0
  • 100 mM EDTA pH 8,0
  • 50 mM NaCl
  • 0,5% SDS
  • 200 ug / ml proteinase K (voeg vlak voor gebruik)

    • 5. DNA schoon te maken

    1. Voeg een gelijk volume van de buffer verzadigd fenol (Fisher, BP1750I-400) en meng door inversie. Spin gedurende ten minste 5 minuten bij 14000 rpm in microcentrifuge.
    2. Breng de waterige laag naar een nieuwe buis. Let op de interfase: is er een veel witte materiaal?
    3. Herhaal de stappen 1 en 2 op de waterige fractie tot de interfase duidelijk is (meestal drie of meer keer). Voer terug extracties * wanneer de interfase is fuzzy tot de uiteindelijke rendement te verhogen.
    4. Zodra de interfase duidelijk is, voeg een gelijk volume van fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) de uitgepakte waterige fractie van uw monster. Mix gedurende 5 minuten en dan draaien gedurende 5 minuten bij 14.000 rpm. Thisreduces resterende fenol en verder de interfase verscherpt, het vergemakkelijken van extractie van de waterlaag
    5. De waterige laag op Verwijderen om een ​​nieuwe buis en treatwith RNase A bij 100 ug / ml gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    6. Herhaal de stappen 1 tot 4 om alle resterende RNase A te verwijderen en de waterige fractie te verzamelen. Je moet alleen maar een of twee buffer verzadigde fenol stappen als er veel minder eiwit te verwijderen dan in het oorspronkelijke lysaat worden.

    * Om terug te voeren extracties toe te voegen 50-100 pl dH 2 0 aan de monsterbuis met de interfase en organische gedeelte. Keer de buis te mengen, en het monster draaien op 14.000 rpm in een microcentrifuge gedurende 5 minuten. Verzamel de waterfase en voeg deze toe aan de eerder verworven extractie met water. Ga verder terug extracties tot de interfase is duidelijk.

    6. DNA neerslag

    1. Schat de volume van uw verzamelde waterlaag.
    2. Voeg 1 / 10 van de volume van 3 M natriumacetaat pH 5,2 en een volume van 100% isopropanol (v / v) moleculaire biologie kwaliteit (of 2,5 volumes van 100% ethanol).
    3. Meng en zet op ijs of in een -20 ° C vriezer voor 30 minuten of 's nachts.
    4. Spin op maximale snelheid (14000 rpm) bij 4 ° C in microcentrifuge gedurende 10 minuten
    5. Verwijder het supernatans.
    6. Was de pellet met 70% ijskoude ethanol om ongewenste zouten te verwijderen.
    7. Re-schorten de pellet in de buffer van keuze (meestal dH 2 O).

    7. DNA kwantificering

    1. Kwantificeer de concentratie van het DNA. De A260: A280-verhouding moet worden ~ 1.8. Voor kleine hoeveelheden DNA, is de meting met behulp van een spectrofotometer NanoDrop voorkeur.
    2. Na de kwantificering, gelelektroforese moeten worden uitgevoerd om de kwaliteit van uw DNA-monster te testen en te bepalen of besmetten RNA is volledig afgebroken.
    3. Hoge kwaliteit geëxtraheerde DNA is nu geschikt voor downstream-toepassingen, of kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. Als RNA is nog steeds aanwezig in de steekproef, herhaal dan de DNA schoon te maken en neerslag stappen, en opnieuw te kwantificeren en kwalificeren van de kwaliteit van uw monsters.

    Discussie

    Biopsie of chirurgisch weggesneden weefsels voor histopathologische analyse en diagnose zijn vaak formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) voor lange termijn opslag. Met de groeiende belangstelling voor het begrijpen van de genetische basis van de ziekte, de mogelijkheid om DNA extraheren uit deze monsters is een onschatbare bron van diagnostisch materiaal dat gebruikt kan worden voor de genomische analyse en translationeel onderzoek. Historisch FFPE monsters werden niet beschouwd als een levensvatbare bron voor moleculaire analyse nucleïnezuren kunnen zwaar gemodificeerd door eiwit-nucleïnezuur en eiwit-eiwit verknoping 6. Echter, de ontdekking dat protease spijsvertering gefragmenteerde nucleïnezuren die geschikt zijn voor downstream-analyses waaronder PCR, array CGH, sequencing en methylering profilering releases, maakt het gebruik van deze waardevolle exemplaren voor genetische analyse 6.

    DNA-extractie van paraffine-ingebed weefsel is een deugdelijke procedure die is gebaseerd op differentiële oplosbaarheid aan DNA te zuiveren. Geëxtraheerde DNA kwaliteit en kwantiteit en het succes van de latere DNA-amplificatie is afhankelijk van een aantal parameters voor, tijdens en na de extractie. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot: type en de hoeveelheid weefsel, het type fixatief gebruikt voor weefsel behoud, de duur van de fixatie, de leeftijd van het paraffineblok en opslagcondities, evenals de lengte van het gewenste DNA-segment worden versterkt 1,7. Verwijdering van paraffine uit het weefsel is de meest kritische stap voor een succesvolle extractie als onopgelost paraffine leidt tot slechte kwaliteit staal en remming van de PCR-amplificatie.

    Openbaarmakingen

    Geen belangenconflicten verklaard.

    Dankbetuigingen

    We willen graag de leden van het Lam laboratorium bedanken voor hun evaluatie en kritieken van deze video en artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit het Canadese Institutes for Health Research.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Naam Vennootschap Catalogus Nummer Reacties
    Xyleen VWR CABDH6216-4 -
    1,7 ml SafeSeal Reactievaatjes Sorenson BioScience 11510 -
    Spectrafuge 16M Reactievaatjes LabNet C0160-B -
    Lysis Buffer - - 10 mM Tris-HCl pH8,
    100 mM EDTA pH 8,
    50 mM NaCl,
    0,5% SDS,
    200 ug / ml proteïnase K
    Proteinase K Stock Solution Invitrogen AM2548 20 mg / ml
    Proteinase K Stock Solution
    Buffer Verzadigde Fenol pH 6.6/7.9 Visser BP1750I-400 -
    Fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) Visser BP1752I-400 -
    RNase A Roche 10109169001 100mg
    3M natriumacetaat pH 5,2 - - 40.81g NaOAc in 80ml
    Aan te passen aan de pH 5,2 met ijsazijn
    Voeg dH 2 O tot 100 ml
    Autoclaaf
    ND 3300 Spectrofotometer NanoDrop - -

    Referenties

    1. Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
    2. Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
    3. Sambrook, J. oseph, R, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
    4. Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
    5. Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
    6. Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
    7. Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    XyleenbehandelingethanolrehydratieProteinase K digestiefenolextractieRNase A behandelingDNA precipitatieethanolwasspectrometrische analyse

    Gerelateerde artikelen