Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

Summary

Dendritische cellen opname van antigenen en migreren naar immuun organen verwerkte antigenen presenteren aan T-cellen. Qdot nanokristallen etiket zorgt voor een langdurige en stabiele fluorescerende signaal. Dit maakt het volgen van dendritische cellen om verschillende organen van fluorescentie microscopie.

Abstract

Dendritische cellen (DC's) zijn professionele antigeen presenterende cellen (APC's) gevonden in de perifere weefsels en in de immunologische organen zoals zwezerik, beenmerg, milt, lymfeklieren en plaques van Peyer ^1-3. DC's aanwezig in de perifere weefsels monster van het organisme op de aanwezigheid van antigenen, die ze opnemen, verwerken en presenteren van hun oppervlakte in het kader van major histocompatibility moleculen (MHC). Dan, antigeen-beladen DC's te migreren naar immunologische organen, waar ze de verwerkte antigeen presenteren aan T-lymfocyten activeren specifieke immuunrespons. Een manier om de migratie mogelijkheden van DC's te beoordelen is om ze het etiket met fluorescerende kleurstoffen ^4.

Hiermee tonen we het gebruik van fluorescerende Qdot nanokristallen voor muriene beenmerg-afgeleide DC label. Het voordeel van deze etikettering is dat Qdot nanokristallen stabiele en langdurige fluorescentie die maken ze ideaal voor het opsporen van gelabelde cellen in weefsels hersteld bezitten. Om dit te bereiken, eerst cellen worden verhaald op muizen bot courgettes en gekweekt gedurende 8 dagen in de aanwezigheid van granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor om DC differentiatie te induceren. Deze cellen worden vervolgens gelabeld met fluorescerende Qdots door korte in-vitro incubatie. Gekleurde cellen kan worden gevisualiseerd met een fluorescentie microscopie. Cellen kunnen worden geïnjecteerd in proefdieren op dit punt of kan tot rijpe cellen die bij in vitro incubatie worden met een inflammatoire stimuli. In onze handen, heeft DC rijping niet bepalen verlies van fluorescent signaal noch Qdot vlekken van invloed op de biologische eigenschappen van DCs. Na injectie kunnen deze cellen worden geïdentificeerd in het immuunsysteem van organen door fluorescentie microscopie volgende typische dissectie en fixatie.

Protocol

1. Dissectie van de muis scheen-en tibiae en de cultuur van beenmergcellen

1. Offer twee muizen door CO ₂ stikken en zorgvuldig dij-en bovenbenen ontleden zonder het snijden van de botuiteinden.
2. Reinig de botten van alle aangesloten weefsels met behulp van tissue papier. Wees voorzichtig niet naar de botten te breken.
3. Steriliseer de botten door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 10 minuten in een 35 mm petrischaal. Vanaf dit moment werk binnen een bioveiligheid kap om verontreiniging van het celculturen te vermijden.
4. Herstel de botten van de ethanol en laat ze drogen aan de lucht gedurende 5 min in een petrischaal in de bioveiligheid kast.
5. Snijd de dijbenen in de helft, en het scheenbeen van zijn dunste punt. Infundeer de binnenkant van het bot met 1 ml RPMI medium (zonder serum, maar met antibiotica) met behulp van een steriele spuit op een steriele petrischaal.
6. De celsuspensie wordt verzameld en gewassen 2X in RPMI medium door 10 min centrifugeren in een 15 ml centrifugebuis op 1100 RPM in een gekoelde centrifuge (4 ° C) met een swingende emmer rotor.
7. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de cellen in 2 ml van ACK lysis buffer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in om rode bloedcellen te elimineren.
8. Voeg 13 ml RPMI met 10% FBS, mengen en wassen 2X in dit medium met dezelfde instellingen, zoals beschreven in 1.6.
9. Tellen cellen, aan te passen aan 2 x 10 ⁵ cellen / ml RPMI met 10% FBS, en voeg rm-GM-CSF (20 ng / ml uiteindelijke concentratie) ^5.
10. Voeg 10 ml van deze suspensie aan een steriele, microbiologische kwaliteit, 10 cm petrischaaltje, en cultuur in een CO ₂ incubator (37 ° C, 5% CO _2).
11. Drie dagen later, nog een 10 ml RPMI 10% FBS met 20 ng / l rmGM-CSF aan elk van de bereide platen.
12. Drie dagen later 10 ml celsuspensie worden verhaald op elke petrischaal, gecentrifugeerd zoals in 1.6, geresuspendeerd in hetzelfde volume van RPMI 10% FBS met rmGM-CSF en keerde terug naar de petrischaal. Cellen worden gekweekt voor de twee extra dagen in de CO _2-incubator.

2. Inzameling en de etikettering van DC's

1. Na 8 dagen in kweek losjes adherente cellen worden teruggewonnen door het wassen van de petrischalen met vers medium. Dit protocol maakt rond 2-4 x10 ⁸ DC's in onze handen. Cellen kunnen worden geanalyseerd op DC fenotype door flowcytometrie.
2. Verzamelde cellen worden dan voorzien van het Qtracker 655 Cell Labeling Kit strikt volgens de instructies van de fabrikant.
3. We hebben uitstekende resultaten etikettering van muizen beenmerg-afgeleide DC's met Qdots op een 10 nM concentratie. Om dit te bereiken, fracties van Qtracker Cell Labeling Kit-onderdelen A en B worden gemengd in gelijke hoeveelheden, geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en onmiddellijk verdund 1 / 100 in vers medium met vortexen voor 30 s.
4. Om vlek 5 x 10 ⁶ DC's, mix 5 pi van elke kit onderdelen A en B in een eppendorfbuisje en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Dan, voeg 1 ml RPMI 10% FBS incubeer en vortex voor 30 seconden.
5. Voeg 0,5 ml celsuspensie met 5 x10 ⁶ DC's, en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
6. Vervolgens wassen cellen 2X in RPMI 10% FBS (1100 RPM). Cellen kunnen worden gesuspendeerd in RPMI voor verdere cultuur of in PBS voor injectie in een experimentele muizen.

3. Evaluatie van het label DC

1. Cel de etikettering kunnen worden geëvalueerd door middel van fluorescentie microscopie. Om dit te bereiken, is een druppel celsuspensie toegevoegd aan een microscoopglaasje, bedekt met een glazen dekglaasje, en geëvalueerd met een fluorescentiemicroscoop ermee rekening houdend dat deze Qdots emissie en excitatie spectra van 565nm en 405-525nm hebben respectievelijk (afb. 3 )
2. Op dit punt, kan de gelabelde cellen die worden gebruikt om dieren te injecteren, of rijping kan worden geïnduceerd door het incuberen van deze cellen gedurende 48 uur (37 ° C, 5 CO ₂₎ in de aanwezigheid van LPS (100 ng / ml) en TNF-( 20 ng / ml). TL-etikettering is niet beïnvloed door DC rijping (afb. 4).

4. Representatieve resultaten:

Hierbij beschreven we hoe de muis beenmerg-afgeleide DC's voor te bereiden en hoe ze gelabeld met fluorescerende Qdots. Fig. Een overzicht gegeven van de procedure voor het verkrijgen van de cel, terwijl Fig. 2 geeft de procedure om ze label met Qdots. Zoals getoond in Fig. 3, bijna alle cellen zijn gelabeld door deze procedure, en dit is niet beïnvloed door DC rijping met inflammatoire factoren (afb. 4). Fig. 5 laat zien dat Qdot-lood DC (Fig.5a) gedragen zich vergelijkbaar met niet-gekleurde cellen die worden behandeld met een ontstekingsremmende cocktail. Beide celpreparaten eveneens upregulate uitdrukking van costimulatoire moleculen (Fig. 5b); en produceren vergelijkbare bedragen van IL-6 (Fig. 5c) en stikstofoxide (fig. 5d) na rijping stimuli. Dit is het eens met vorige boekjaarlende gepubliceerde gegevens waaruit blijkt dat Qdot vlekken geen invloed op de capaciteit van DC te zetten tot rijpe cellen die in staat tot het opwekken van immuunreacties [6]. Deze cellen kunnen vervolgens gebruikt worden voor het inspuiten van proefdieren. Zoals getoond in Fig. 6, 2 dagen na de intraveneuze injectie van gelabelde DCs in muizen, konden we Qdot-gekleurde cellen te detecteren in de milt. Dit is ook in overeenstemming met eerder gepubliceerde gegevens waaruit blijkt dat het gebruik van Qdot nanokristallen de migratie van DC te evalueren in vivo [6] door niet-invasieve beeldvorming en flowcytometrie.

Figuur 1. Stroomdiagram van de DC-generatie uit het beenmerg. Hierbij hebben we beschrijven het proces om beenmerg-afgeleide DC te verkrijgen. Zowel de dij-en bovenbenen worden ontleed en schoon uit de omliggende weefsel. Bone tips zijn bewaard gebleven en het interieur van de botten zijn gespoeld met medium. Na eliminatie van rode bloedcellen, worden beenmergcellen gekweekt gedurende 8 dagen in de aanwezigheid van GM-CSF om ze te differentiëren in DC's.

Figuur 2. Stroomschema van de etikettering procedure. Gelijke hoeveelheden van Qtracker Cell Labeling Kit-onderdelen A en B worden gemengd in een eppendorfbuisje. Dendritische cellen zijn verzameld uit acht-dagen beenmerg culturen met GM-CSF en gemengd met de etikettering kleurstof voor 60 minuten bij 37C. Dan cellen worden gewassen in de media om overtollige etikettering deeltjes te verwijderen.

Figuur 3. Fluorescerend microfotografie van DCs onmiddellijk na labeling. Een daling van gelabelde cellen werd gestort op een glasplaatje en bedekt met een dekglaasje aan. Vervolgens werden monsters geëvalueerd in een fluorescentie microscoop en de beelden werden verworven door middel van een Micropublisher 5.0 Digital Color CCD Camera (Qimaging, Surrey, BC Canada).

Figuur 4. Fluorescent microfotografie van DCs na 48 uur rijping in vitro. Gelabelde DC's werden gekweekt gedurende 48 uur met LPS (100 ng / ml) en TNF-α (20 ng / ml) op glas dia's op een CO ₂ incubator (37 ° C, 5% CO _2). Vervolgens werden monsters gewassen met PBS (5 min, 2X), gefixeerd met aceton (15 min, 4 ° C) en tegengekleurd met DAPI. Cellen werden geëvalueerd in een fluorescentiemicroscoop als hierboven.

Figuur 5. Biologische activiteit van Qdot gekleurde rijpe DCs. Label DC gerijpt in vitro als hierboven werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie (A) en (B). (A) Qdot-gekleurde cellen geven een sterk signaal in de FL3 (PercP) kanaal. Shaded histogram: ongekleurd controle. (B) Qdot-gekleurd en onbesmet DC's waren bovendien gekleurd met specifieke antilichamen tegen rijping markers CD86 en CD40 en isotype controles. Cellen werden vervolgens geanalyseerd in een FACSort flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Daarnaast zijn IL-6 (C) en stikstofoxide (NO) bepaald in supernatanten van rijpe Qdot bevlekte DC's en controles. Niveaus van IL-6 en stikstofoxide werden bepaald door middel van ELISA-analyse en Griess assay zoals we eerder hebben ^{7 beschreven, 8.} Alle gegevens bleek in deze figuur is representatief voor twee of drie onafhankelijke experimenten met soortgelijke resultaten. De gegevens werden geanalyseerd door ANOVA met behulp van de GraphPad software.

Figuur 6. Detectie van gelabelde DC's in ontleed weefsels. Gelabeld rijpe DCs (1x10 ⁶ cellen) werden intraveneus geïnjecteerd in C57BL / 6 muizen. (A) Twee dagen later werden de muizen opgeofferd en de milt worden verzameld, snap bevroren, ingebed in oktober en 8 uM secties bereid met behulp van een cryostaat. Vervolgens werden monsters gefixeerd met aceton (15 min, 4 ° C) en tegengekleurd met DAPI. Cellen werden geëvalueerd in een fluorescentiemicroscoop, zoals hierboven Fig 6a:. 40x vergroting, Fig 6b: 100X vergroting, Fig. 6C, 400X vergroting.

Discussion

Murine myeloïde) DCs zijn uitgebreid gebruikt om de werkzaamheid en de verbetering van de DC-gebaseerde vaccins te bepalen; DC te onderzoeken: T-cel interacties of DC ontwikkeling, en hun rol te bepalen in verschillende ziekten ^9-11. Hiermee laten we zien hoe DC's van de voorlopers hersteld van het bot courgettes van de dij-en bovenbenen te genereren. We herstellen de botten, zonder het snijden van de tips, waardoor we om ze te steriliseren door onderdompeling in ethanol 70%, waardoor de kans op besmetting. Om onderscheid te maken DC's van beenmergcellen we alleen gebruik maken van GM-CSF zoals eerder beschreven ^5. Hoewel sommige protocollen ook gebruik maken van IL-4, is gemeld dat dit cytokine niet nodig is bij het ​​werken met een hoog niveau van GM-CSF ^12. Inderdaad, we hebben eerder aangetoond dat deze DC's in staat zijn om de immuunrespons ¹³ induceren. Ook zorg worden genomen om slechts losjes hechtende cellen te herstellen van 8-dagen culturen door het wassen van de petrischalen met medium sinds bevestigd cellen vertonen een meer monocyt-achtig fenotype. Hier laten we de etikettering van DCs met fluorescerende Qdot deeltjes. Deze labeling heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere methoden. Eerst worden de Qdots deeltjes gemakkelijk opgenomen in de cellen. Ten tweede, het fluorescerende signaal is zeer hoog en wordt niet veranderd door DC rijping. Ten derde, is de fluorescentie niet verloren wanneer de cellen of weefsels worden bevestigd met oplosmiddelen zoals aceton, in tegenstelling tot wat er gebeurt als GFP wordt gebruikt om de DC ^14-tag, het geven van meer flexibiliteit op het moment dat voor vlekken protocollen te kiezen. Ten slotte is de hoge fluorescerende signaal gegeven door deze deeltjes maakt visualisatie van de cellen, ondanks weefsel auto-fluorescentie. Zoals eerder beschreven ^zes, heeft Qdot vlekken geen invloed op de rijping vermogen van deze cellen. Hiermee laten we zien dat Qdot gekleurd DC's gedragen zich op een soortgelijke manier als niet-gekleurde DC's, opregulerende costimulatoire moleculen, en het produceren van IL-6 en stikstofoxide in reactie op inflammatoire stimuli. Hoewel de DC's zijn cellen die gespecialiseerd zijn in het stimuleren van immuunreacties, zijn ze getoond om deel te nemen in pathologische aandoeningen zoals kanker en atherosclerose ^{4, 15, 16.} Ze zijn ook beweerd om deel te nemen in angiogene proces ^{17, 18,} ​​zelfs voorgesteld als structureel deel te nemen aan het ontwikkelen van nieuwe schepen ^{19, 20.} Zo, methoden die het mogelijk maken voor DC tracking in vivo, en het bepalen van hun geografische lokalisatie in verschillende weefsels ^{4, 21, 22} zijn zeer waardevol.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
C57BL / 6 muizen	Jackson laboratoria		Vrouwtjes, 6-8 weken oud
RPMI	Invitrogen	11875-119
Foetaal runderserum, gekwalificeerde	Invitrogen	10437-028
Antibiotica-antimycotische	Invitrogen	15240-096
PBS	Invitrogen	10010-049
ACK lyserende Buffer	Lonza Walkersville, Inc	10-548E
Recombinant muizen GM-CSF	PeproTech Inc	315-03
Qtracker 655 Cel Labeling Kit	Invitrogen	Q25021MP
Lipopolysaccharide	Invivogen	tlrl-eblps
Recombinant muizen TNF-alfa	Peprotech	315-01A
CD86 antilichaam	BD Biosciences	553691
CD40 antilichaam	BD Biosciences	553791
Griess reagens systeem	Promega	G2930
IL-6 capture antilichaam	eBioscience	13-7061-81
IL-6 detectieantilichaam	eBioscience	13-7062-81