$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Enten van tumor in de aviaire embryo CAM
- Bereid shell-minder bevruchte kippenembryo's, zoals beschreven 8.
- Op dag 9 van de embryonale ontwikkeling, monteren een micro-injector met behulp van een 18-gauge naald is aangesloten op 1 ml spuit. Snijd een 5-6 centimeter stuk Tygon slang (1 / 32 "inwendige diameter, 3 / 32" buitendiameter, 1 / 32 "wanddikte) en voorzichtig bevel van de naald in de slang. Ongeveer 4-5 cm van de slang moet uitstrekken van het uiteinde van de naald (figuur 1a).
- Vul de spuit en slang met een celsuspensie. Plaats vervolgens een micro-injectie glazen naald aan het uiteinde van de slang en verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen.
- Injecteer Dag 9 embryo's (Figuur 1b) onder een dissectie bereik met een lamp met 10.000-100.000 kankercellen als een bolus in de CAM (figuur 1c). Injecteer langzaam cellen en zorgvuldig ervoor te zorgen dat de naald op de juiste plaats voor de cellen om een zichtbare bolus vormen binnen de CAM. Cellen die druppelen op de CAM oppervlak kan worden schoongemaakt met Kimwipe of andere applicator.
- Keer terug naar embryo's bevochtigde incubator bij 38 ° C bij 60% luchtvochtigheid en laat tumor te groeien en vascularize (tot 7 dagen).
2. De voorbereiding van nanodeeltjes
- Om fluorescent gelabelde CPMV nanodeeltjes voor te bereiden voor injectie in het kippenembryo, verdunnen de virale nanodeeltjes (zoals gesynthetiseerd in 8 in PBS, pH 7,4, tot een concentratie van 100 ug / ml Vortex mengsel goed voor het gebruik en centrifugeer gedurende een minuut een te verwijderen. aggregaten. Ultrasoonbehandeling kan ook nuttig zijn, afhankelijk van conjugaten en de mate van aggregatie. Voorraden van de fluorescent gelabelde CPMVs stabiel zijn gedurende tenminste een jaar indien bewaard bij 4 ° C in het donker. Controleer regelmatig of voorraden door er een paar druppels op een glasplaatje en controleren op fluorescentie. Transmissie Elektronen Microscopie (TEM) kan ook gebruikt worden om te bepalen of de deeltjes bleef intact na conjugatie.
- Kortom, kan een microgram van virale nanodeeltjes (in een eindvolume van 2 pl) worden toegevoegd aan de koper beklede roosters. Voeg vervolgens een gelijk volume van 2% uranylacetaat gedurende 1 minuut bij elektronenmicroscoop (Philips EM 410).
3. Intraveneuze injectie van fluorescent gelabelde virale nanodeeltjes
- Op dag 16, assembleren micro-injector zoals hierboven beschreven. Het opstellen van gewenste volume van virale nanodeeltjes door middel van de slang in de spuit (> 200 pi). Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen. Steek micro-injectie glazen naald aan het uiteinde van de slang. Zorg ervoor dat de naald is zo lang en taps toelopende mogelijk (Figuur 2a). Als de naald is te bot, zal het niet kunnen doorboren via het ectoderm en zal niet aan het schip binnen te dringen. Als de naald is te scherp, zal de tip instorten bij het betreden van weefsel.
- Spuit 100 ul van 1 mg / ml fluoresceïne dextran (MW 70.000 Da, Invitrogen) in tumor dragende embryo distaal van de gewenste site te visualiseren (Figuur 3d). Succesvolle canulatie van CAM ader is duidelijk door het opruimen van bloed in het pad van de injectie debiet (Figuur 2b). Beoordeel vasculaire lek een uur na de injectie.
- Spuit 50 ul van 1 mg / ml oplossing van CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) of gepegyleerd CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) in de embryo's met tumoren met vasculaire lekkage distaal van de gewenste site aan gevisualiseerd worden.
- Afbeelding tumoren onmiddellijk en elk uur na het injecteren met behulp van een Zeiss examinator Z1 rechtop microscoop uitgerust met een Yokogawa draaiende schijf, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-camera.
4. Real-time beeldvorming intravitale
- Te monteren het embryo imaging unit, een dun laagje van vacuüm vet rond de omtrek van de imaging-poort aan de onderkant van het deksel van de embryo imaging unit, en passen een 18 mm glazen dekglaasje op de haven.
- Plaats de embryo zodanig dat de dekglaasje zal het gewenste gebied voor de beeldvorming te dekken. Langzaam de deksel totdat het dekglaasje net contact maakt met het embryo, en schroef het deksel op het apparaat om het te zijn plaats te houden (figuur 2c).
- Voeg het water verwarmd tot 37 ° C in het embryo beeldeenheid buiten het schaaltje met het embryo, en vervolgens de gehele eenheid plaats op het podium van een rechtopstaande confocale microscoop met de binnenkant klimaatkamer evenwicht tot 37 ° C.
- Plaats de beeldeenheid met de embryo onder de draaiende schijf confocale fluorescentie microscoop (figuur 2e). De beeldeenheid houdt het embryo in en houden het gezichtsveld vast tijdens het vastleggen van beelden, zodat voor zowel de drie-dimensionale Z stacks en time-lapse beelden worden vastgelegd. We verwerven en analyseren van drie-dimensionale time-lapse beelden met behulp van Perkin Elmer's (voorheen Improvisation) Volocity software pakket (figuur 3a). Acquire een hoge-resolutie driedimensionale stapel van de tumor en de omringende bloedvaten te visualiseren detailed structurele analyses op specifieke tijdstippen. Acquire driedimensionale schoorstenen op regelmatige tijdstippen om gedetailleerde structurele veranderingen in de tumorvasculatuur kaart. Afbeelding tumoren elk uur na de injectie.
- Kwantificeren de opname van virale nanodeeltjes door het berekenen van de gemiddelde Alexa Fluor (AF) 647 signaal binnen de geselecteerde gebieden in de tumor of in het stroma (niet-tumor gebied) met behulp van beeld kwantificatie software zoals Volocity (Perkin Elmer). De tumor stroma ratio berekend door de gemiddelde AF 647-signaal in de tumor meer dan de gemiddelde AF 647-signaal in het stroma. Een tumor / stroma-ratio hoger dan 1 geeft aan dat de nanodeeltjes wordt ingenomen door de tumor.
5. Representatieve resultaten:
In het voorbeeld hier beschreven, we geïnjecteerd HT-29 dikke darm kankercellen naar een bolus van ongeveer 1 mm in grootte vorm binnen de CAM van de dag 9 kippenembryo's (Figuur 1b). Na inoculatie werden de embryo's gekweekt voor 7 dagen in een vochtige incubator om voldoende groei van de tumor en de vascularisatie (figuur 1c) toe te staan. Embryo's werden intraveneus geïnjecteerd met een laag moleculair gewicht dextran aan tumor vascularisatie te bevestigen, en de tumoren werden gevisualiseerd onder de Zeiss AxioExaminer Z1 rechtop microscoop (figuur 2d).
Na intraveneuze toediening van CPMV-AF 647 of CPMV-PEG-AF 647 nanodeeltjes (Figuur 3a en b), hoge-resolutie real-time confocale imaging (figuur 2e) bleek dat zowel de CPMV en CPMV-PEG nanodeeltjes snel bestempeld als de gehele vaatstelsel, maar de opname van CPMV-PEG door de tumor was ongeveer drie keer hoger dan CPMV na 12 uur (figuur 3a). De relatieve tumor opname van nanodeeltjes werd bepaald met behulp van beeldanalyse-software (Volocity van Perkin Elmer). Regio's van belang zijn geselecteerd binnen en buiten de tumor (in de stromale compartiment) en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk werd bepaald. Worden uitgedrukt als tumor / stroma ratio.
Figuur 1. Micro-injectie van tumoren in de CAM van een aviaire embryo. (A) Het micro-injectie apparaat is samengesteld uit de onderdelen zoals aangegeven. (B) Aviaire embryo's op dag 9 zijn klaar om te worden ingeënt met tumor als de CAM heeft verspreid naar het gehele oppervlak te dekken. (C) Op dag 16, zal de tumor gegroeid tot maximaal 1 cm in diameter (stippellijn) en is klaar voor de injectie met nanodeeltjes.
Figuur 2. Nanodeeltje injectie en intravitale beeldvorming. Injectie onder een microscoop met dissectie (a) de tip van de naald microinjector klaar om te worden geïnjecteerd in de ader CAM en (b) de microinjector naald ingebracht in de ader (aangegeven met pijl) en nanodeeltjes geïnjecteerd in de bloedstroom (gezien door clearing van het bloed). (C) Imaging unit met aviaire embryo met het dekglaasje interface direct met de CAM. (D) Alvorens met nanodeeltjes injectie, is tumor vascularisatie beoordeeld aan de hand intravitale beeldvorming na injectie van fluoresceïne dextran. (E) Imaging eenheid waarin de embryo geplaatst op het toneel van een rechtopstaande confocale microscoop in een temperatuur-gereguleerde behuizing ingesteld op 37 ° C.
Figuur 3. Intravitale visualisatie van nanodeeltjes opname in de menselijke tumoren. Tumoren worden gevisualiseerd 7 uur na injectie van (een) CPMV-AF647 en (b) CPMV-PEG-AF647. d) Excisie van de tumor zijn van aviaire embryo voor verdere analyse.