Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton

Samenvatting

Milieu-bacterioplankton worden geïncubeerd met een model opgeloste organische koolstof (DOC) verbinding en een DNA-etikettering reagens, broomdeoxyuridine (BrdU). Daarna zijn DOC-afbrekende cellen gescheiden van de bulk-gemeenschap op basis van hun verhoogde BrdU incorporatie met behulp van fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS). Deze cellen worden vervolgens geïdentificeerd door de volgende moleculaire analyses.

Samenvatting

Microben zijn belangrijke agenten bemiddelen de afbraak van een groot aantal opgeloste organische koolstof (DOC) substraten in het aquatisch milieu. Echter, de identificatie van bacteriële taxa die specifieke zwembaden van DOC te transformeren in de natuur vormt een technische uitdaging.

Hier beschrijven we een aanpak die paren broomdeoxyuridine (BrdU) incorporatie, fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), en 16S rRNA-gen op basis van moleculaire analyse van de cultuur-onafhankelijke identificatie van bacterioplankton in staat vernederende een specifieke DOC compound in het aquatisch milieu mogelijk maakt. Drievoud bacterioplankton microkosmossen zijn ingesteld om zowel BrdU en een model DOC verbinding (DOC amendementen), of alleen BrdU (no-toevoeging controle) te ontvangen. BrdU vervangt de posities van thymidine in nieuw gesynthetiseerde bacteriële DNA en BrdU-gelabeld DNA kan gemakkelijk immunodetected ^1,2 te zijn. Door middel van een 24-uurs incubatie bacterioplankton die in staat zijn om gebruik maken van de toegevoegde DOC compound wordt verwacht dat ze selectief worden geactiveerd, en dus hogere niveaus van BrdU incorporatie (HI cellen) dan niet-ontvankelijk cellen in de DOC wijzigingen en cellen in no- Naast controles (lage BrdU incorporatie cellen, LI-cellen). Na de fluorescentie immunodetectie, zijn HI cellen onderscheiden en fysiek gescheiden van de LI cellen door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) ^3. Gesorteerd DOC-responsieve cellen (HI-cellen) zijn gewonnen voor DNA en taxonomisch geïdentificeerd door middel van de volgende 16S rRNA gen-gebaseerde analyses waaronder PCR, klonen bibliotheek bouw en sequencing.

Protocol

1. Watermonster verwerking

1. Filter 10L milieu water door middel van een urn-poriegrootte membraanfilters tot grote deeltjes en bacteriovores te verwijderen. Verzamel het water filtraat in een mandfles.
2. Transfer 36 ml filtraat elk in drie steriele Eppendorf buisjes (50 ml) met 4 ml vers bereide paraformaldehyde-oplossing (PFA, 10%). Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur aan cellen te behouden. Verzamel cellen op 0,22-um-poriegrootte wit membraanfilters door vacuüm filtratie. Was het filter door het passeren 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door het filter door vacuümfiltratie. Label de filters als negatieve controles en bewaar ze bij -20 ° C.

Stappen 1.3-1.4 zijn optioneel voor de oprichting van DOC-beperkte voorwaarden.

3. Voeg een mengsel van anorganische stikstof en fosfor (5 uM NH ₄ Cl, 5 uM NaNO _3, en 1 uM NaH ₂ PO ₄ uiteindelijke concentratie) in de mandfles.
4. Incubeer in het donker bij in situ temperatuur gedurende 48 uur met af en toe onrust.

2. Microkosmos vestiging en incubatie

1. Vul elk van de zes 1-L glazen bokalen met 800 ml water monster uit de mandfles van stap 1.4 tot microkosmossen vast te stellen. Voeg BrdU (10 uM, uiteindelijke concentratie) aan elke microkosmos. Meng goed.
2. Voeg 1 ml model DOC samengestelde oplossing in drie van de microkosmos, zullen deze dienen als DOC wijzigingen. Voeg 1 ml steriele PBS in de drie overgebleven microkosmos, zullen deze dienen als no-toevoeging controles.
3. Broed alle microkosmossen in een incubator shaker en incubeer in het donker bij in situ temperatuur, terwijl schudden bij 100 rpm.
4. Verzamel 36 ml water monster van de microkosmos en overbrengen naar 50 ml steriele Eppendorf buisjes op de tijdstippen van 0, 8, 16 en 24 uur. Onmiddellijk toevoegen 4 ml verse PFA (10%) aan inzameling buizen en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur om de cellen te behouden.
5. Filter bewaard cellen door middel van 0.22-um-poriegrootte membraanfilters van polycarbonaat. Was de filters met 10 ml PBS. Ga meteen naar de volgende stap of bewaar de filters bij -20 ° C.

3. In situ immunodetectie voor BrdU Incorporation

1. Ontdooi de filters (DOC gewijzigd monsters, no-toevoeging controles en negatieve controles) bij kamertemperatuur.
2. Breng 1 ml van lysozym-oplossing [10 mg / ml lysozym eiwit in 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] ⁴ tot en met bacteriële cellen op het filter te dekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was het filter door het passeren 10 ml PBS erdoor onder afzuiging.
3. Voeg 1 ml proteinase K-oplossing [2 mg / ml proteinase K in 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] ⁴ tot en met bacteriële cellen op het filter te dekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was het filter door het passeren 10 ml PBS erdoor onder afzuiging.
4. Voeg 1 ml exonuclease oplossing [exonuclease III (50 U / ml) in 5 mM MgCl ₂ en 50 mM Tris-HCl] ⁵ om bacteriële cellen op het filter te dekken. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Was het filter door het passeren 10 ml PBS erdoor onder afzuiging.
5. Monteer frame-seal incubatie kamers (Bio-Rad) volgens de instructies van de fabrikant.
6. Snijd de filter in achtsten met behulp van een steriel mes op een alcohol-gereinigde droge ondergrond.
7. Met behulp van een tang, plaats een achtste deel van een filter in een samengesteld beeld-seal incubatiekamer (acht frame-seal kamers zijn nodig voor elk filter monster). De zijkant van de filter sectie die cellen bevat moet naar boven wijzen. Het vocht aan de achterkant van het filter kan de filter vasthouden aan de dia. Als filter wordt droog, breng een kleine druppel (2 pi) van dih ₂ O in het midden van de kamer voor het plaatsen van de filter sectie op de dia.

Stappen 3.8-3.20 gebruik van de reagentia van de ROCHE In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS volgende procedures gewijzigd ten opzichte van de instructies van de fabrikant. Behalve voor PBS, zijn alle reagentia voorzien in de kit.

8. Breng voldoende incubatiebuffer (0,5% bovine serum albumine, 0,1% Tween20 in PBS,) om de gehele filter sectie in de incubatiekamer gelijkmatig te dekken zonder dat overloop als de afdichting wordt toegepast.
9. Plaats een polyester beeld cover over de incubatiekamer frame. Druk op DOWN om goed verzegeling van de incubatiekamer. Vermijd luchtbellen boven het filter. Incubeer de verzegelde kamers voor 10 min bij kamertemperatuur in het donker.
10. Verwijder de afdichting polyester en open de incubatie kamers. (Opmerking: het openen van de kamers soms trek het frame zegel van de glijbaan in dat geval een nieuwe kamer voor de volgende stappen voor te bereiden..)
11. Pipet uit de incubatie buffer van de ene hoek van de kamer. Vermijd contact met het filter.
12. Was het filter door voorzichtig pipetteren 100 pi PBS in enuit de kamer 3 keer.
13. Bereid anti-BrdU-FLUOS werkende oplossing de stappen te volgen zoals aanbevolen door de fabrikant onmiddellijk voor gebruik.
14. Pipet 120 ul anti-BrdU-FLUOS werkende oplossing op het filter, zorg ervoor dat gelijkmatig bestrijken het gehele oppervlak.
15. Sluit de kamer met een nieuwe polyester dekken. Vermijd luchtbellen op de top van het filter. Incubeer de kamer in het donker bij 37 ° C gedurende 3 uur. Deze stap zal label BrdU opgenomen DNA in situ met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC).
16. Verwijder de polyester deksel en open de incubatiekamer. Pipet uit de anti-BrdU-FLUOS werkende oplossing. Was het filter 3 keer met PBS.
17. Breng de filter uit de incubatiekamer om een ​​steriel oppervlak. Snijd de filter sectie in kleine stukjes met behulp van een steriel mes.
18. Breng de filter stukjes in 2 ml microcentrifuge buizen, die elk 1 ml PBS. Stevig dop van de tube en sluit met parafilm. Incubeer bij 37 ° C en 200 rpm gedurende 10 minuten.
19. Bevestig de buizen op een vortexer en vortex op de maximale snelheid gedurende 5 minuten. Pipet het supernatant in een steriele 15 ml Eppendorf buis. Herhaal de incubatie-en vortex stappen voor 5 keer. Combineer de bovenstaande vloeistof in dezelfde 15 ml Eppendorf buis voor elk monster. Meestal kan 80% cellen worden teruggevonden in de suspensie.
20. Bewaar het supernatant met geresuspendeerd cellen bij 4 ° C. Sorteer binnen 2 dagen.

4. FACS-analyse

Een procedure voor een BD FACSAria flowcytometer en de bijbehorende software is hier beschreven.

1. Optimaliseren van de instelling van de flowcytometer volgende stappen aanbevolen door de fabrikant. Dit houdt in: het aanpassen van de versterking controle op de gewenste breakoff parameters en de 'sweet spot' vast te stellen; het optimaliseren van de laser vertraging en het gebied schaalfactoren voor het experiment schede druk en het optimaliseren van de instellingen voor FSC en SSC voltages, FSC drempel, FSC fluorescentie schalen, fluorescentie PMT voltages , etc.
2. Run negatieve controlemonsters op de flowcytometer (FCM) op basis van fluorescentie-intensiteit van FITC en zijwaartse verstrooiing (SSC). Verhoog de FITC drempel tot er geen cellen in de negatieve controles kan worden gevisualiseerd door de FITC-SSC overname weer te geven.
3. Run no-toevoeging te controleren steekproeven en onderzoekt de distributie patroon van 10.000 cellen op basis van FITC en SSC acquisitie. Definieer een poort naar alle cellen omsluiten en te wijzen als "lage intensiteit cellen" (LIS).
4. Run DOC-gewijzigd samples en onderzoekt de distributie patroon van 10.000 cellen op basis van FITC en SSC. Sommige cellen zal verschijnen in de vooraf ingestelde LI poort. Definieer een poort naar de cellen die hogere fluorescentie-intensiteit (HIS) dan LI hebben omsluiten. Verwerven van statistieken om de relatieve overvloed van gated cellen te bekijken.
5. Sorteer HI-cellen in de collectie van buisjes die 500 ul PBS bij "zuiveren een drop"-modus. Beëindig het sorteren wanneer het aantal van zijn bereikt 500.000 telt.

5. Filter PCR-amplificatie van 16S rRNA genen

Filter PCR-procedures zijn gewijzigd van Kirchman et al. ^6.

1. Filter gesorteerde cellen op een witte, 0,22 um-porie-formaat, 25 mm diameter, polycarbonaat membraanfilter. Snij de rand van het filter dat geen bacteriële cellen met behulp van een steriel mes bevat. Snijd de filter in acht even grote stukken.
2. Plaats een filter stuk in een PCR-reactie buis, met de cellen naar binnen van de buis. Voeg 45 ul PCR kwaliteit water in de PCR-reactie buis. Dompel het filter volledig in het water.
3. Voeg 2 ROCHE illustratie PuReTaq Read-To-Go PCR Beads in de PCR reactie buis, kort vortex. Voeg 2 pi van elk van de voor-en achteruit 16S rRNA-gen primers (0,4 uM uiteindelijke concentratie voor elke primer), zoals 27V en 1492R ^7, in elk van de PCR-reactie buizen.
4. (Optioneel) Voeg 1μl bovine serum albumine-oplossing (BSA, uiteindelijke concentratie 30μg/100 ul) om de PCR-reactiemengsel te adsorberen versterking remmers te helpen. Als men ervoor kiest om niet toe te voegen BSA, in plaats toe te voegen 1μl van water.
5. Uitvoeren van PCR-amplificatie op een thermal cycler. Een touch down PCR-programma wordt aanbevolen, dat heeft de annealing temperatuur opeenvolgend af 62 tot 52 ° C met 1 ° C per cyclus voor 11 cycli, gevolgd door 15 cycli met een annealing temperatuur van 52 ° C. Alle cycli zijn denatureren (bij 95 ° C), gloeien (op 62 tot 52 ° C), en extensie (bij 72 ° C) stappen van jaren '50 duur. Een eerste 3-min denaturatie en laatste 10-min uitbreiding stap is ook opgenomen in het PCR-programma.
6. Bevestig PCR-amplificatie door elektroforese op een ethidiumbromide gekleurde 1% agarose gel. Accijnzen de PCR-amplicons uit de gel en schoon met de QIAGEN QIAquick gel extractie kit.
7. Voer twee extra PCR amplificaties voor elk monster, elke keer gebruik maken van een nieuwe filter sectie. Na de PCR-gel purificatiop, het zwembad van het amplicons van hetzelfde monster bij elkaar. Gezuiverd 16S rDNA amplicons zijn nu klaar voor een aantal moleculaire analyses die taxonomische identificatie, zoals kloon bibliotheek bouw en sequencing mogelijk te maken.

6. Representatieve resultaten:

Representatieve resultaten worden beschreven met behulp van een studie van putrescine-afbrekende bacteriën als een voorbeeld. Watermonsters werden verzameld uit een kust plaats van Georgië en verwerkt volgens de hierboven beschreven procedures. FACS-analyse toonde aan dat putrescine toevoeging ontwikkeling van een groep van bacteriën met een hoge FITC fluorescentie-intensiteit veroorzaakt, wat aangeeft hoge BrdU incorporatie (Figuur 1). Deze cellen werden aangeduid als high-BrdU incorporatie-cellen (HIS) en werd verwacht dat ze meestal bevatten putrescine-afbrekende bacteriën. HIs ontbraken in de no-toevoeging controles, die alleen die cellen met lagere niveaus van BrdU incorporatie (LIS). LI werd verwacht dat vooral bevatten bacterioplankton die niet in staat waren om toegevoegd putrescine gebruiken. HIs werden gesorteerd in aparte buizen en vervolgens verzameld op membraanfilters. 16S rRNA-gen amplicons werden verkregen voor hoge HI cellen met behulp van PCR-filter.

Figuur 1. Flowcytometrische analyse van no-naast-controle en model-compound-gewijzigd (putrescine als een voorbeeld hier) monsters verzameld na 24 uur incubatie. Celverdeling analyse was gebaseerd op (1) fluorescentie-intensiteit van FITC etikettering (x-as), wat positief is gerelateerd aan het niveau van BrdU incorporatie, en (2) zijwaartse verstrooiing (SSC, y-as), dat is positief gerelateerd aan cel grootte. Gate notatie is gebaseerd op het niveau van BrdU incorporatie, (HI, high-BrdU-opname, LI, low-BrdU-opname). Het relatieve aandeel van de HI-en LI-cellen worden weergegeven in de overeenkomstige poorten.

Discussie

Onze aanpak koppels BrdU incorporatie, FACS en 16S rDNA analyse soort-niveau identificatie van bacterioplankton dat de afzonderlijke DOC componenten metaboliseren in het aquatisch milieu mogelijk te maken. De BrdU incorporatie assay labels bacteriële cellen op basis van metabolische activiteiten, die analyse maakt het mogelijk alleen op actieve bacteriën en dus bevat geen slapende cellen. In onze aanpak, BrdU incorporatie is in situ immunodetected en bacteriën die verschillende niveaus van BrdU incorporatie heb...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam	Type	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
BrdU	Reagens	Sigma	B5002-5G
Lysozym	Reagens	Sigma	L6876-5G
Proteinase K	Reagens	Sigma	P2308-25mg
In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS	Uitrusting	Roche	11810740001	Verbruiken meer van anti-BrdU-FLUOS en Incubatiecentrum buffer per reactie dan wordt gesuggereerd door de fabrikant.
Frame-Seal Incubatie Chambers	Materiaal	Bio-Rad	SLF-1201
Membraanfilters van polycarbonaat (142 mm diameter, 1,0 um-porie-formaat)	Materiaal	Millipore	FALP14250
Membraanfilters van polycarbonaat (25-mm-diameter van 0,2 micrometer-porie-formaat)	Materiaal	Millipore	FGLP02500
illustratie PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads	Uitrusting	GE Healthcare	27-9559-01
QIAquick gelextractiekit	Uitrusting	QIAGEN	28704
FailSafe PCR-systeem	Uitrusting	EPICENTRUM	FS99060