Milieu-bacterioplankton worden geïncubeerd met een model opgeloste organische koolstof (DOC) verbinding en een DNA-etikettering reagens, broomdeoxyuridine (BrdU). Daarna zijn DOC-afbrekende cellen gescheiden van de bulk-gemeenschap op basis van hun verhoogde BrdU incorporatie met behulp van fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS). Deze cellen worden vervolgens geïdentificeerd door de volgende moleculaire analyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Microben zijn belangrijke agenten bemiddelen de afbraak van een groot aantal opgeloste organische koolstof (DOC) substraten in het aquatisch milieu. Echter, de identificatie van bacteriële taxa die specifieke zwembaden van DOC te transformeren in de natuur vormt een technische uitdaging.
Hier beschrijven we een aanpak die paren broomdeoxyuridine (BrdU) incorporatie, fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), en 16S rRNA-gen op basis van moleculaire analyse van de cultuur-onafhankelijke identificatie van bacterioplankton in staat vernederende een specifieke DOC compound in het aquatisch milieu mogelijk maakt. Drievoud bacterioplankton microkosmossen zijn ingesteld om zowel BrdU en een model DOC verbinding (DOC amendementen), of alleen BrdU (no-toevoeging controle) te ontvangen. BrdU vervangt de posities van thymidine in nieuw gesynthetiseerde bacteriële DNA en BrdU-gelabeld DNA kan gemakkelijk immunodetected 1,2 te zijn. Door middel van een 24-uurs incubatie bacterioplankton die in staat zijn om gebruik maken van de toegevoegde DOC compound wordt verwacht dat ze selectief worden geactiveerd, en dus hogere niveaus van BrdU incorporatie (HI cellen) dan niet-ontvankelijk cellen in de DOC wijzigingen en cellen in no- Naast controles (lage BrdU incorporatie cellen, LI-cellen). Na de fluorescentie immunodetectie, zijn HI cellen onderscheiden en fysiek gescheiden van de LI cellen door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) 3. Gesorteerd DOC-responsieve cellen (HI-cellen) zijn gewonnen voor DNA en taxonomisch geïdentificeerd door middel van de volgende 16S rRNA gen-gebaseerde analyses waaronder PCR, klonen bibliotheek bouw en sequencing.
Protocol
1. Watermonster verwerking
- Filter 10L milieu water door middel van een urn-poriegrootte membraanfilters tot grote deeltjes en bacteriovores te verwijderen. Verzamel het water filtraat in een mandfles.
- Transfer 36 ml filtraat elk in drie steriele Eppendorf buisjes (50 ml) met 4 ml vers bereide paraformaldehyde-oplossing (PFA, 10%). Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur aan cellen te behouden. Verzamel cellen op 0,22-um-poriegrootte wit membraanfilters door vacuüm filtratie. Was het filter door het passeren 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door het filter door vacuümfiltratie. Label de filters als negatieve controles en bewaar ze bij -20 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Onze aanpak koppels BrdU incorporatie, FACS en 16S rDNA analyse soort-niveau identificatie van bacterioplankton dat de afzonderlijke DOC componenten metaboliseren in het aquatisch milieu mogelijk te maken. De BrdU incorporatie assay labels bacteriële cellen op basis van metabolische activiteiten, die analyse maakt het mogelijk alleen op actieve bacteriën en dus bevat geen slapende cellen. In onze aanpak, BrdU incorporatie is in situ immunodetected en bacteriën die verschillende niveaus van BrdU incorporatie heb.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Financiering van dit project werd verzorgd door de National Science Foundation verleent OCE1029607 (tot XM) en MCB0702125 (tot MAM) en de Gordon en Betty Moore Foundation (tot MAM).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Naam | Type | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| BrdU | Reagens | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozym | Reagens | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagens | Sigma | P2308-25mg | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Uitrusting | Roche | 11810740001 | Verbruiken meer van anti-BrdU-FLUOS en Incubatiecentrum buffer per reactie dan wordt gesuggereerd door de fabrikant. |
| Frame-Seal Incubatie Chambers | Materiaal | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Membraanfilters van polycarbonaat (142 mm diameter, 1,0 um-porie-formaat) | Materiaal | Millipore | FALP14250 | |
| Membraanfilters van polycarbonaat (25-mm-diameter van 0,2 micrometer-porie-formaat) | Materiaal | Millipore | FGLP02500 | |
| illustratie PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Uitrusting | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gelextractiekit | Uitrusting | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR-systeem | Uitrusting | EPICENTRUM | FS99060 |
Referenties
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
