Cecal Ligatie Puncture Procedure

Samenvatting

De muis model van cecal ligatie en lek als een waardevol instrument voor de studie van de menselijke sepsis.

Samenvatting

Human sepsis wordt gekenmerkt door een reeks van systemische reacties in reactie op een intensieve en massale infectie die niet ter plaatse te worden opgenomen door de gastheer. Op dit moment, sepsis behoort tot de top tien oorzaken van sterfte in de Verenigde Staten intensive care units ^1. Tijdens sepsis zijn er twee gevestigde hemodynamische fasen die kunnen elkaar overlappen. De eerste fase (hyperdynamische) wordt gedefinieerd als een enorme productie van pro-inflammatoire cytokines en reactive oxygen species door macrofagen en neutrofielen dat vasculaire permeabiliteit (leidend tot hypotensie), hartfunctie beïnvloedt en leidt tot metabole veranderingen culminerend in weefsel necrose en orgaanfalen. Bijgevolg is de meest voorkomende oorzaak van sterfte is acute nierschade. De tweede fase (hypodynamic) is een anti-inflammatoire proces waarbij veranderde monocyten antigen presentatie, verminderde lymfocyten proliferatie en de functie en verhoogde apoptose. Deze staat bekend als immunosuppressie of immuun depressie verhoogt sterk het risico op infecties nocosomial en uiteindelijk de dood. De mechanismen van deze pathofysiologische processen zijn niet goed getypeerd. Omdat beide fasen van sepsis kan leiden tot onherstelbare en onherstelbare schade, is het essentieel om vast te stellen de immunologische en fysiologische status van de patiënt. Dit is de belangrijkste reden waarom veel therapeutische medicijnen zijn mislukt. Hetzelfde geneesmiddel gegeven in verschillende stadia van sepsis kan worden therapeutische of anderszins schadelijk of hebben geen effect ^2,3. Sepsis te begrijpen op verschillende niveaus is het cruciaal om een geschikte en uitgebreide diermodel dat het klinische verloop van de ziekte reproduceert hebben. Het is belangrijk om de pathofysiologische mechanismen die tijdens sepsis karakteriseren en het model voorwaarden voor het testen van potentiële therapeutische middelen te controleren.

Voor het bestuderen van het ontstaan ​​van de menselijke sepsis onderzoekers hebben ontwikkeld verschillende diermodellen. De meest gebruikte klinische model is cecal ligatie en prik (CLP). De CLP-model bestaat uit de perforatie van de blindedarm waardoor de release van fecaal materiaal in de buikholte om een ​​verergerd immuunrespons geïnduceerd door polymicrobiële infectie te genereren. Dit model voldoet aan de menselijke conditie, dat is klinisch relevant. Als bij mensen, muizen die CLP ondergaan met vloeistof reanimatie tonen de eerste (vroege) hyperdynamische fase die in de tijd ontwikkelt tot de tweede (late) hypodynamic fase. Daarnaast is de cytokine profiel is gelijk aan dat in de menselijke sepsis waar sprake is van verhoogde lymfocyten apoptose (beoordeeld in ^4,5). Als gevolg van de meerdere en overlappende mechanismen die betrokken zijn bij sepsis, onderzoekers moeten een geschikte sepsis model van gecontroleerde ernst met het oog op consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.

Protocol

1. Cecal Ligatie en Prik als een muismodel voor Human Sepsis

Voor deze procedure C57BL / 6 muizen (7-9 weken oud) worden gebruikt.

1. Verdoven van de muis door het injecteren van intraperitoneaal een oplossing van 1:1 ketamine (75mg/kg) en xylazine (15mg/kg). Als referentie, injecteren 30 ul van de 1:1-oplossing in een muis met een gewicht van 20 gram. Als alternatief kunnen muizen worden verdoofd met isofluraan geïnhaleerd met behulp van een verdoving vaporizer.
2. Scheer de buik van de muis en desinfecteren gebied door eerst betadine oplossing gevolgd door af te vegen met een 70% alcohol (nummer 1 in de reeks van plaatjes hieronder). Chloorhexidine kan worden gebruikt als een alternatief ontsmettingsmiddel. Optioneel: een steriel laken kan worden gebruikt om het gebied schoon te houden.
3. Onder aseptische omstandigheden, de praktijk een 1 tot 2 cm middellijn laparotomie en bloot de blindedarm met aangrenzende darm (2 en 3).
4. De blindedarm is strak geligeerd met een 6,0 zijden hechtdraad (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) aan de basis onder de ileo-cecal klep, en is geperforeerd of twee keer met een 19-gauge naald (4 en 5) op dezelfde kant van de blindedarm. Houdt u er rekening mee dat de lengte van de geligeerde blindedarm gedefinieerd als de afstand van het distale einde van de blindedarm te ligatie punt zal de mate van ernst te bepalen. Een afstand van> 1 cm produceert hoogwaardige sepsis, terwijl een afstand van ≤ 1 cm produceert midden-tot lage kwaliteit sepsis. Merk ook op dat het gebruik van de blindedarmkeutels perforatie methode hier getoond wordt is verschillend van de standaard door en door punctie techniek (de invoering van een naald door de blindedarm). Beide methoden betrouwbaar leveren hetzelfde resultaat sepsis. Echter, een nadeel van de door en door techniek is dat het niet gemakkelijker regelen van de hoeveelheid ontlasting geëxtrudeerd als de blindedarm wordt geperst.
5. De blindedarm is vervolgens voorzichtig geperst om een ​​kleine hoeveelheid ontlasting extruderen van de perforatie sites (6). De blindedarm wordt teruggegeven aan de buikholte en het buikvlies wordt gesloten met 6,0 zijden hechtingen. (7).
6. De huid wordt gesloten met Reflex 7mm clips (RS-9258, Roboz chirurgische instrumenten) of Michel wond clips (7 mm, RS-9270) (8).
7. Reanimeren muizen door het injecteren subcutaan 1 ml van de voorverwarmde 0,9% zoutoplossing met behulp van een 25G naald. Deze vloeistof reanimatie maatregel zal leiden tot de hyperdynamische fase van sepsis. Deze kritische stap verder is beschreven in de discussie sectie.
8. Optioneel: Injecteer onderhuids buprenorfine (0,05 mg / kg lichaamsgewicht) of tramadol (20mg/kg lichaamsgewicht) voor post-operatieve analgesie. Er rekening mee dat deze opiaten kan de ademhaling en beweging te onderdrukken en deze effecten kunnen verkeerd worden geïnterpreteerd als tekenen van sepsis.
9. De dieren worden tijdelijk geplaatst op een verwarmingselement of als alternatief weer onmiddellijk naar een kooi met blootstelling aan een infrarood warmte lamp van 150W tot ze herstellen van de narcose. Het herstel is vanaf 30 minuten tot 1 uur.
10. Bieden gratis toegang tot voedsel en water (hydrogel) geplaatst op de bodem van de kooi.
11. Muizen worden bewaakt elke 12 uur om te overleven voor een tot twee weken of gedood op verschillende tijdstippen voor de analyse van de verschillende parameters.

Als controle voor de experimentele opzet, sham dieren zou de laparotomie techniek te volgen zonder ligatie en punctie.
Zes tot 12 uur na de chirurgische procedure muizen zullen worden lusteloos en koorts, pilo-erectie, diarree, verdringt, en malaise, alle symptomen van sepsis. Muizen met zeer ernstige sepsis kan nauwelijks bewegen voorafgaand aan het overlijden en vertonen een dramatische daling van de lichaamstemperatuur. Op deze stap muizen moeten worden gedood om langdurige pijn en lijden te voorkomen.

2. Meest voorkomende geanalyseerde parameters

Het evalueren van de uitkomst van de procedure, kunnen verschillende parameters worden geanalyseerd in organen, cel-extracten of lichaamsvloeistoffen. Monsters kunnen worden verzameld op verschillende tijdstippen van drie uur tot een week na de chirurgische ingreep.

1. Muizen overleven.
2. Cytokines en chemokines in het serum, buikholte en orgel extracten.
   1. Interleukine-6: Geproduceerd en vrijgegeven door monocyten, dendritische cellen, macrofagen, B-cellen, T-cellen, granulocyten, mestcellen en nog veel meer soorten cellen. Het speelt een belangrijke rol in de acute fase reactie en ontsteking.
   2. Tumor necrose factor-α: Pleiotrophic cytokine die een centrale rol bij ontstekingen en apoptose speelt. Geproduceerd door monocyten, macrofagen, neutrofielen, dendritische cellen en fibroblasten.
   3. nterleukin-1β: Geproduceerd door monocyten, NK-cellen, dendritische cellen, B-cellen en T-cellen. Induceert koorts en acute fase eiwit synthese.
   4. Interleukine 10: Bevordert fagocytische opname en Th2 reacties op, maar onderdrukt antigen presentatie en Th1 pro-inflammatoire reacties.
   5. Interleukine 10: Bevordert fagocytische opname en Th2 reacties op, maar onderdrukt antigeen presentatie en Th1 pro-inflammatoire reacties.
   6. Monocyt chemotactische proteïne-1 (ook bekend als CCL2): Recruits monocyten, geheugen T-cellen, en dendritische cellen naar sites van weefselbeschadiging en infectie.
   7. KC (CXCL1): Geproduceerd door macrofagen en endotheelcellen. Muis KC is een krachtige neutrofiele lokstof en activator.
   8. RANTES: Een monocyten chemoattractant. Het kan chemoattract gestimuleerde CD4 + / CD45RO + memory T-cellen en gestimuleerd CD4 + en CD8 + T-cellen met na ve en geheugen fenotypes.
   9. Interferon-γ: afgescheiden door Th1-cellen, cytotoxische T-cellen, dendritische cellen en natural killer (NK) cellen. Verhoogt antigen presentatie en lytische activiteit in macrofagen en onderdrukt Th2 cel-activiteit. Bevordert de hechting en binding die nodig zijn voor migratie van leukocyten en bevordert de NK-cel activiteit.
   10. High-Mobility Group B-1 eiwit: In monocyten is een nucleaire factor kappa B activator door te binden aan de cellulaire receptor voor de vervroegde glycatie eindproducten (RAGE), het activeren van de release van pro-inflammatoire mediatoren in de late fase van sepsis.
3. Myeloperoxidase bepaling in organen als een maatregel van neutrofielen infiltratie. Myeloperoxidase (MPO) is een enzym peroxidase het meest overvloedig aanwezig is in neutrofiele granulocyten. Het is een lysosomale eiwit opgeslagen in azurofiele korrels van de neutrofielen. MPO is een heem pigment, die zijn groene kleur veroorzaakt in afscheiding die rijk zijn aan neutrofielen, zoals pus en sommige vormen van slijm.
4. Bacteriën belasting in organen en bloed, te meten als het aantal kolonievormende eenheden per milliliter.

3. Representatieve resultaten

De CLP-procedure werd in eerste instantie uitgevoerd in de C57BL / 6 muizenstam. We testten verschillende parameters te moduleren van de ernst van sepsis door het veranderen van de lengte van de ligatie en de dikte van de naald zoals getoond in de figuren 1 en 2. Tussen deze twee factoren, de lengte van de ligatie lijkt effectiever dan de dikte van de naald procent overleven veranderen. Zoals weergegeven in figuur 1, provoceert het vergroten van de lengte van de ligatie met meer dan 1 cm een toename van de mortaliteit van 100% ten opzichte van muizen met een ligatie van ≤ 1cm. Het verhogen van de dikte van de naald verminderde ook het percentage overleving van 100% (met behulp van een 22G naald) tot 55% (met een 19G naald) met twee lekke banden. We hebben ook het effect getest van CLP op de C57BL / 6 en 129SvJ muizen om te bepalen of de verschillende muizenstammen vergelijkbare of verschillende gevoeligheid display CLP-geïnduceerde sepsis. Figuur 3 laat zien dat onder dezelfde voorwaarden, 129SvJ muizen meer vatbaar zijn voor infectie dan C57BL / 6, aangegeven door een verhoogde mortaliteit procent.

Figuur 1. Effect van ligatie lengte van de blindedarm in dierlijke overleving. CLP werd uitgevoerd in C57BL / 6 muizen met behulp van twee verschillende lengtes van cecal ligatie. Deze ene parameter van invloed op dramatisch dier overleven, omdat alle dieren in de groep met een ligatie gebied langer dan 1 cm stierf in minder dan 3 dagen in vergelijking met een groep dieren met een ligatie oppervlakte van 1 cm ongeveer. (N = 8).

Figuur 2. Invloed van de naald dikte op de overleving. CLP werd uitgevoerd in C57BL / 6 muizen met behulp van twee verschillende naalden maten, 19G en 22G. Muizen met de blindedarm geperforeerd met behulp van een 19G naald toonde een 55-60% overleven. In tegenstelling muizen met de blindedarm geperforeerd met behulp van een 22G naald toonde aan 100% te overleven, hoewel ze typische symptomen van een ontsteking ervaren tijdens de eerste 3-4 dagen, die verdween na 4 dagen (n = 8).

Figuur 3. Vergelijking van sepsis gevoeligheid tussen twee verschillende muizenstammen. De CLP-model is uitgevoerd in 129SvJ en C57BL / 6 onder dezelfde voorwaarden. Aan het einde van de evaluatieperiode het percentage overleving van de 129SvJ stam werd 25% minder dan in de C57BL / 6 stam, wat wijst op een hogere gevoeligheid voor ontstekingen veroorzaakt door polymicrobiële infectie. (N = 6).

Discussie

Hier laten we in detail hoe de CLP-model in muizen uit te voeren en het moduleren van de graad van ernst.

In vergelijking met andere dierlijke modellen van sepsis, kunnen CLP worden uitgevoerd in een muizenstam van verschillende leeftijd en geslacht. Het is een relatief gemakkelijk en goedkoop chirurgische procedure. In dit model, de graad van ernst heeft een directe impact op het percentage van de overleving. De lengte van de ligatie, de dikte van de naald en het aantal lekke banden zijn pa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Ketamine	Ketaset	0856-2013-01
Xylazine	AnaSed	NADA # 139-236
Insulinespuit 29g	Exel	26028
Zijden hechtdraad, 6-0 PROLENE	Ethicon	8680G
19G en 25G Needle	BD	305186
Scheerapparaat	Algemene voorraad	Algemene voorraad
Infrarood warmtelamp	Algemene voorraad	Algemene voorraad
Michel wond clips 7mm	Roboz Chirurgische Instr	RS-9270
Ear Loop Mask	Fisher Scientific	19-130-4181
Dissection schaar	Roboz Chirurgische Instr	RS-6702
Betadine oplossing	VWR	63410-992
Chirurgische tang	Roboz Chirurgische Instr	RS-5135
70% isopropylalcohol pad	Fisher Scientific	22-031-350
Buprenorfine	Bedford Labs	55390-100-10
Tramadol	Sigma-Aldrich	42965