Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo</em

Samenvatting

We presenteren een lentivirale techniek voor genetische manipulatie en visualisatie van een olfactorische sensorische neuron axon en de terminal arborization In vivo.

Samenvatting

De ontwikkeling van een nauwkeurige olfactorische circuit is gebaseerd op nauwkeurige projectie van olfactorische sensorische neuron (OSN) axonen naar hun synaptische doelen in de bulbus olfactorius (OB). De moleculaire mechanismen van OSN axongroei en targeting worden niet goed begrepen. Het manipuleren van genexpressie en de daaropvolgende visualiseren van enkele OSN axonen en hun terminal prieel morfologie zijn tot nu toe uitdagend. Om te studeren gen functie op de enkele cel niveau binnen een bepaalde termijn, ontwikkelden we een lentivirale gebaseerde techniek om genexpressie te manipuleren in OSNs in vivo. Lentivirale deeltjes worden geleverd aan OSNs door micro-injectie in het reukepitheel (OE). Expressiecassettes worden dan permanent geïntegreerd in het genoom van getransduceerde OSNs. Groen fluorescerend eiwit expressie herkent besmette OSNs en schetst hun hele morfologie, inclusief de axon terminal prieel. Vanwege de korte doorlooptijd tussen de micro-injectie en verslaggever detectie, kunnen genen functie studies worden geconcentreerd binnen een zeer nauwe periode van ontwikkeling. Met deze methode hebben we ontdekt GFP expressie binnen slechts drie dagen en zo lang als drie maanden na de injectie. We hebben bereikt zowel over-expressie en shRNA gemedieerde knock-down door lentiviraal micro-injectie. Deze methode biedt gedetailleerde morfologie van de OSN cellichamen en axonen op de single cell niveau in vivo, en dus maakt karakterisering van kandidaat-gen olfactorische functie tijdens ontwikkeling.

Protocol

1. Voorbereiding

Deze procedure is bioveiligheidsniveau 2, dus alle de volgende voorbereidingen worden gemaakt in een biohazard kap, waar de micro-injectie procedure wordt uitgevoerd.

1. Voor te bereiden en verwarm een ​​37 ° C waterbed: Vul een plastic zak met water - afdichting en ingesteld op een lege verwarmingsblok incubator. Dit zal toelaten muizen om na de injectie te herstellen.
2. Vul een biologisch afval container met 10% bleekwater om een ​​geschikte volume voor immersie van alle afval van deze procedure.
3. Bereid een kleine open schotel van 70% ethanol en een tweede gerecht met gesteriliseerd ddH2O en plaats in de biologische veiligheid kabinet.
4. Steriliseren een 5μL capaciteit Hamilton spuit met een 33-gauge naald door het sproeien van het lichaam naar beneden en de naald met 70% ethanol met de zuiger haalde alles uit de weg. Herhaaldelijk aspireren ethanol uit de schotel en verwijder het helemaal ten minste 5 keer.
5. Spoel de spuit cartridge door opzuigen en uitstoten van steriel water minstens 5 keer. Plaats spuit veilig opzij in de cultuur motorkap en laat ze drogen.
6. Verwijder de virale voorraden van -80 ° C vriezer opslag en plaats op het ijs te laten ontdooien. Micro-injectie nodig 2μL van het virus voorraad per muis op een titer van 10 ⁹ infectieuze eenheden / ml. Lentivirussen kan worden verkregen uit commerciële bronnen of geproduceerd in het laboratorium op basis van het vastgestelde protocol (Lois et al.., 2002).
7. Bereid een injectie stadium dat een gebied dat hoog boven de motorkap oppervlak biedt - kan een 10cm cultuur schotel bedekt met een vel Kimwipe gebruik.
8. Schik alcoholdoekjes de buurt van de injectie station.

2. Micro-injectie van lentivirale deeltjes in het reukepitheel

Alle dierlijke ingrepen uitgevoerd in deze methode worden uitgevoerd volgens de IACUC goedgekeurde richtlijnen. De Mus musculus stam C57BL/6J is het diermodel gebruikt in alle experimenten toonden hier.

1. Verdoof muis pups door onderkoeling door het nemen van een muis pup (P0-P3) uit de kooi en zetten de pup op een cut-open handschoen op ijs gedurende 5 minuten.
2. In afwachting van de pup volledig onder narcose, aspiratie 2μL van virale voorraad zijn in de gesteriliseerde Hamilton spuit.
3. Plaats de muis pup op de top van de injectie podium. Voorzichtig trek de huid van de bovenkant van het hoofd bij het oor naar de bovenkant van de hals. Dit moet een les huidoppervlak over de neusholte en zullen verlichten injectie.
4. Steek de naald door de bovenkant van de neusholte ongeveer 3 mm onder het huidoppervlak aan het reukepitheel te bereiken. Microinject 0.5μL van virus-oplossing per shot, het kiezen van twee locaties per kant, zowel links als rechts (vier injecties totaal per muis = 2μL van de benodigde virus). Injectieplaatsen moeten worden gespreid uit elkaar. Voor het richten van de juiste injectieplaatsen, zoek het dorsale schedel oppervlak voor de omtrek van de bulbus olfactorius. Deze lijn is nauwelijks zichtbaar bij de geboorte door de semi-doorschijnende huid en de schedel. Om twee injecties per kant, tot doel een injectie net rostraal van een bol schetsen op een mediale as. Maak de tweede inbrengen lateraal van de lamp schetsen, maar zorg ervoor dat de injectie mediaal hoek, zodat u kunt het reukepitheel, dat ventraal zich bevindt onder de lamp te bereiken. Vermijd het penetreren van de bulbus olfactorius!
5. Dep droog eventueel resterende virus oplossing of bloed kan ontsnappen uit de injectieplaats of neusgat openingen met behulp van een Kimwipe. Direct over Kimwipes in de verdunde bleekwater biohazard container.
6. Plaats de geïnjecteerde muis op het waterbed incubator.
7. Herhaal stap 1-4 voor alle muizen in te spuiten, herinneren u over 2μL van het virus voorraad per muis nodig hebt.
8. Laat muizen terug op het waterbed incubator gedurende 30 minuten alvorens terug te keren naar de oorspronkelijke nest kooi.
9. Gooi micro-injectie podium, schoonmaken doekjes en eventuele extra schoonmaak papier producten in het bleekwater biohazard beschikking.
10. Reinig de Hamilton spuit door herhaalde aspiratie en uitwerpen van ethanol en vervolgens met water zoals in de voorbereiding stappen. Laat de spuit om te drogen.
11. Voor maximale transductie-efficiëntie herhalen deze procedure in 4 uur. Geïnfecteerde OSNs kan worden gevisualiseerd door de lengte van de cel in slechts drie dagen.

3. Immunohistochemie van drijvende bulbus olfactorius secties

1. Offer de geïnjecteerde muis op het gewenste tijdstip en perfusie van het weefsel vast met 4% paraformaldehyde. Ontleden de OB. Incubeer in paraformaldehyde 's nachts en dan 30% sucrose in PBS' s nachts. Insluiten in OCT inbedmedium op droog ijs.
2. Coronale OB secties zijn verkregen bij een 60μm dikte met behulp van een cryostaat. Veeg de lamp secties in een 10cm cultuur schotel met 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Onderdelen moeten worden gehouden zweven in PBS tot oktober te laten dissolve. Overdracht drijvende secties en PBS in een 50 ml conische flacon.
3. Laat secties om zich te vestigen op de bodem van de flacon. Stofzuigen PBS zonder zuigen alle secties. Spoel weefselcoupes met 20 ml PBS. Herhalen bezinken en stofzuigen stappen. Resuspendeer weefsel met 10 ml PBS en overdracht zwevende delen om een ​​15 ml flacon voor conische immunokleuring. Zodra weefselcoupes hebben gevestigd, stofzuigen PBS supernatans zonder storende weefsel. Resuspendeer secties met 0,3% Triton X-100 in 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx), waardoor het reinigen van celmembranen perforeren. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vacuüm af supernatant en herhaal de incubatie met PBS-Tx twee keer.
4. Incubeer weefselcoupes in 10 ml van het blokkeren van oplossing (5% paard serum in PBS-Tx) gedurende twee uur bij kamertemperatuur.
5. Spoel het blokkeren oplossing ten minste tweemaal met PBS-Tx gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
6. Bereid 2 ml van een primair antilichaam oplossing in PBS-Tx. Zie Reagentia en apparatuur sectie voor antilichamen gebruikt in dit experiment.
7. Vervang seconden PBS-Tx blokkeren wassen met primair antilichaam oplossing. Incubeer op een langzaam rockende platform (~ 30rpm) bij 4 ° C gedurende 24-48 uur een grondige penetratie zorgen in de 60μm drijvende secties.
8. Na de incubatie kan het primaire antilichaam oplossing worden opgehaald voorzichtig met een pipet en opgeslagen bij 4 ° C voor hergebruik nog maximaal twee keer binnen twee weken zonder noemenswaardig verlies van kleuringsintensiteit.
9. Was secties drie keer in PBS-Tx 20 minuten elk bij kamertemperatuur met zachte rotatie (~ 30rpm).
10. Bereid 2 ml van de secundaire antilichaamverdunning in PBS-Tx. Stofzuiger uit de laatste wasbeurt en voeg secundair antilichaam oplossing voor weefselcoupes. Wikkel de buitenkant van de kleuring flacon in aluminiumfolie om het licht, die fluorofoor fotobleken kan veroorzaken blokkeren. Plaats gewikkeld flacon op een langzaam schommelend platform en incuberen bij 4 ° C gedurende de nacht.
11. Gooi secundair antilichaam-oplossing door met een stofzuiger weg. Een keer wassen secties met PBS-Tx voor elk 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel twee extra keer met PBS (pH 7,4) gedurende 20 minuten elke bij kamertemperatuur. Monteer de gekleurde weefselcoupes op glasplaatjes met Fluoromount G.
12. Het scherm door middel van gekleurde coupes voor het positief besmet OSN axonen en axon termini met een fluorescentiemicroscoop.
13. Voor het construeren van een drie dimensionaal beeld van een label OSN axon en terminal prieel, een reeks van optische secties door het 60μm diepte van de doelgroep OB weefsel slice (langs de z-as) met behulp van confocale microscopie.
14. Deze stapel van Z-sectie beelden kunnen vervolgens worden geprojecteerd samen om een ​​360 ° roterende perspectief van een enkel label OSN axon, inclusief terminal prieel detail in zijn geheel te reconstrueren. Ieder een enkel draaihoek kunnen worden vastgelegd en worden uitgevoerd als een image-bestand (dat wil zeggen JPG, TIFF) voor 2D-indeling de presentatie.

4. Representatieve resultaten

Met de hier beschreven methoden, kunnen wij transduceren olfactorische sensorische neuronen door lentivirus in vivo. We hebben tot nu toe gevisualiseerd besmet OSNs met GFP en mCherry fluorescerende verslaggevers, maar ook met een myc-gelabeld fusie-eiwit via immunocytochemie. Deze techniek zorgt voor een overvloed van geïnfecteerde OSNs. Nog steeds, transductie sporadisch voorkomt genoeg om individueel gelabeld OSNs te bieden, waardoor voor de analyse van enkele cel morfologie. Axonen en axon terminals worden afgebeeld binnen OB weefselcoupes temidden van hun eigen omgeving door confocale microscopie (figuur 1). De hele OSN axon terminal prieel kan meestal worden geboeid in een 40-50μm optische gedeelte. Hoge vergroting van geïnfecteerde OSN axon terminals maakt gedetailleerde analyse van axonale prieel morfologie bij de glomerulaire laag.

Figuur 1. Traject van enkele olfactorische sensorische neuron axon en haar terminal prieel. A) een coronale deel van de bulbus olfactorius van een P7 muis met de reukzenuw laag (ONL) immunostained voor de OMP (rood) en de glomerulaire laag (GL) immunostained met zowel OMP en Vglut2 (grijs). Een enkele olfactorische sensorische neuron axon uiten van GFP (groen) reist binnen de ONL en doordringt in de glomerulaire structuur. B) De axon terminal prieel morfologie binnen de glomerulus duidelijk gemarkeerd door GFP expressie. Vglut2 co-kleuring in grijs verlicht de totale glomular gebied waarbinnen de GFP-positieve axon werkt een terminal abortus. C) Lentivirale besmet OSNs uiten van GFP (groen) in de OE. De cytostructure van het reukepitheel wordt weergegeven met DAPI kleuring (blauw). GFP expressie maakt visualisatie van OSN cellichamen en hun cellulaire processen in de OE. D) Een OSN axon en de terminal morfologie met Rap1GAP2 expressie naar knock-door shRNA. Lentivirussen het dragen van een dubbele expressiecassette met Rap1GAP2 shRNA onder de muis U6 promotor en GFP onder eenCMV promoter werden toegepast op de OE. Geïnfecteerde olfactorische axon terminals vertoonden een meer vereenvoudigde terminal prieel in vergelijking met dat van de GFP enige controle. Bar = 20μm.

Discussie

Micro-injectie van lentivirus resulteert in een permanente overdracht van gen-constructen in OSN genomisch DNA. Deze aanpak stelt ons in staat om te presteren op korte termijn of lange termijn manipulaties van kandidaat-genen via overexpressie of shRNA gemedieerde knock-down. Daarnaast kunnen we fluorescent label single OSNs in een bestaande transgene muis lijn naar co-lokalisatie van geurende receptor populaties te observeren. Micro-injectie is nodig voor lentiviraal transductie van OSNs. We hebben geprobeerd spoelen l...

Materialen