Een In vitro Werkwijze voor de bereiding functionele glucocorticoid receptor (GR) • hsp90 eiwitcomplexen uit gezuiverde eiwitten en cellulaire lysaten wordt beschreven. De methode maakt gebruik van immunoadsorption van recombinant GR, gevolgd door zout-strippen en eiwitcomplex reconstitutie. Het belang van co-factoren en de buffer omstandigheden worden besproken, evenals potentiële methode toepassingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Biochemische Reconstitutie van Steroid Receptor • Hsp90 eiwitcomplexen en reactivering van Ligand binding
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hsp90 is een essentieel en zeer overvloedige moleculaire chaperonne-eiwit dat is gevonden om meer dan 150 eukaryote signaaleiwitten, waaronder transcriptie factoren (bv. nucleaire receptoren, p53) en proteïne kinases (bijv. Src, Raf, Akt kinase) die betrokken zijn in cel fietsen te reguleren, ontstaan van tumoren, apoptose, en meerdere eukaryote signaleringsroutes 1,2. Van deze vele 'klant' eiwitten voor hsp90, de assemblage van steroïde receptoren • hsp90 complexen is gedefinieerd de beste (Figuur 1). We presenteren hier een aanpasbaar glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitatie assay en in vitro GR • hsp90 reconstructie methode die gemakkelijk kunnen worden gebruikt om de eukaryote hsp90 functionele activiteit, hsp90-gemedieerde steroïde receptor ligand binding, en moleculaire chaperone cofactor eisen sonde. Bijvoorbeeld, kan deze test gebruikt worden om hsp90 cofactor eisen en de effecten van het toevoegen van exogene verbindingen aan de reconstitutie te testen.
De GR is een bijzonder handig systeem voor het bestuderen van hsp90, omdat de receptor moet worden gebonden aan hsp90 naar een open kloof ligand binding die toegankelijk is voor steroïde 3 hebben. Endogene, unliganded GR is aanwezig in het cytoplasma van zoogdiercellen niet-covalent gebonden aan hsp90. Zoals gevonden in de endogene GR • hsp90 heterocomplex, de GR gespleten ligand binding is open en in staat te binden steroïde. Als hsp90 distantieert van de GR, of als de functie wordt geremd, de receptor niet in staat is te binden steroïde en vereist reconstitutie van het GR • hsp90 heterocomplex voor steroïde-bindende activiteit wordt hersteld 4. GR kan worden immunogeprecipiteerd van cel cytosol met behulp van een monoklonaal antilichaam, en eiwitten zoals hsp90 gecomplexeerd aan de GR kan worden getest door western blot. Steroïde-bindende activiteit van de immunogeprecipiteerd GR kan worden bepaald door het incuberen van de immunopellet met [3 H] steroïde.
Eerdere experimenten hebben aangetoond hsp90-gemedieerde opening van de GR gespleten ligand binding vereist hsp70, een tweede moleculaire chaperon ook essentieel voor de eukaryote cel levensvatbaarheid. Biochemische activiteit van hsp90 en hsp70 worden gekatalyseerd door co-chaperonne-eiwitten Hop, hsp40, en P23 5. Een multiprotein chaperonne apparatuur die hsp90, hsp70, Hop, en hsp40 zijn endogeen aanwezig zijn in eukaryote cel cytoplasma, en de reticulocyten lysaat biedt een chaperonne-rijk eiwit bron 6.
In de gepresenteerde methode, is GR immunoadsorbed van cel cytosol en ontdaan van de endogene hsp90/hsp70 chaperonne machines met een milde zout omstandigheden. Het zout-gestripte GR wordt vervolgens geïncubeerd met reticulocyten lysaat, ATP, en K +, wat resulteert in de reconstructie van de GR • hsp90 heterocomplex en reactivering van steroïde-bindende activiteit 7. Deze methode kan worden gebruikt om de effecten van verschillende chaperonne co-factoren, nieuwe eiwitten, en experimentele hsp90 of GR-remmers test in om hun functionele betekenis op hsp90-gemedieerde steroïde-bindende 8-11 te bepalen.
Protocol
1. De voorbereiding van de cel cytosol met functionele GR
- Technische noot: Alle buffers moeten worden gekoeld en elke stap van dit protocol, met inbegrip van centrifugations en incubatie, moeten uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C, tenzij anders vermeld. De lage temperatuur is essentieel voor de afbraak van de GR en eiwit-complexen te voorkomen.
- Met behulp van een gekoelde centrifuge, het verkrijgen van een ~ 1-5 ml pellet van cellen die een hoge concentratie van functionele GR uitdrukt. Voorbeelden van cel bronnen rijk aan GR onder andere muis fibroblast L929 cellen, die een hoge concentratie van endogene GR te uiten, en Sf9 cellen die zijn geïnfecte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De test hierboven beschreven kan worden aangepast aan een groot aantal aandoeningen van de chaperonne acties van de hsp90/hsp70-based chaperonne machines, alsook GR steroïde-bindende test. Het is een wijziging van de eerder gerapporteerde methoden 4,8,9,17 en is ontworpen om te profiteren van recente ontwikkelingen in de elektroforese-technologie en toegankelijk voor een breder onderzoek gemeenschap. Extra cofactoren of eiwitten van belang kunnen worden toegevoegd aan de GR • hsp90 heterocomplex reconstitutie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Selecteer elektroforese reagentia en beeldanalyse-software werden geleverd door Bio-Rad.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health te verlenen GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences Award, en de MJ Murdock Charitable Trust College Science Research Program. Selecteer elektroforese reagentia en beeldanalyse-software werden genereus geleverd door Bio-Rad.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
| Sf9 insectencellen | Invitrogen | voor baculovirus expressie van recombinant muis GR | |
| L929 cellen | ATCC | CRL-2173 | voor de endogene muis GR cytosol voorbereiding (alternatief voor baculovirus expressie) |
| FiGR hybridoomcellen | ATCC | CRL-2173 | voor het bereiden van ascites met een anti-GR monoklonaal antilichaam (alternatief voor gezuiverd BuGR2 antilichaam) |
| Compleet-Mini proteaseremmer, EDTA-vrij | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| proteïne A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| konijn reticulocyten lysaat | Green Hectares (Oregon, WI) | rijke bron van endogene hsp90/hsp70 chaperonne machines | |
| creatinefosfokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | voor het ATP-regenererend systeem |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | voor het ATP-regenererend systeem |
| anti-GR muis monoklonaal antilichaam (BuGR2) | Pierce / Thermo Scientific | MA1-510 | gebruikt voor het GR immunoadsorption en als primaire antilichaam in western blotting |
| anti-hsp90 muis monoklonaal antilichaam (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | gebruikt als primair antilichaam in western blotting |
| anti-Hsp70 muis monoklonaal antilichaam (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | gebruikt als primair antilichaam in western blotting |
| IgG van muis serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | gebruikt als nonimmune antilichaam voor negatieve controle van immunoadsorption |
| anti-muis IgG-peroxidase conjugaat | Sigma-Aldrich | A4416 | gebruikt als secundair antilichaam in western blotting |
| Experion microfluïdische elektroforese-systeem | Bio-Rad | 7007001 | alternatief voor conventionele SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7 - 3 H] dexamethason | PerkinElmer | NET1192001MC | Volg veiligheidsvoorschriften |
Referenties
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
