Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

Summary

Een tapping mode atomic force microscoop (AFM) methode voor de visualisatie van plasmide DNA, cytoplasmatische eiwitten en DNA-eiwitcomplexen is beschreven. De methode bestaat uit alternatieve benaderingen voor het bereiden van monsters voor AFM beeldvorming volgende biochemische manipulatie. DNA met specifieke eiwit interactie regio's zijn waargenomen in de buurt-fysiologische buffer omstandigheden.

Abstract

Atomaire kracht microscopie (AFM) maakt het visualiseren van de afzonderlijke eiwitten, DNA-moleculen, eiwit-eiwit-complexen, en DNA-eiwitcomplexen. Aan het einde van cantilever de microscoop is een nano-schaal sonde, die doorkruist delen van het beeld, variërend van nanometers tot micrometers, het meten van de hoogte van macromoleculen rust op de ondergrond op een bepaald punt. Elektrostatische krachten veroorzaken eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en te losjes hechten aan de ondergrond in willekeurige oriëntatie en beeldvorming mogelijk te maken. De gegenereerde data lijken op een topografische kaart, waar de macromoleculen op te lossen als drie-dimensionale deeltjes van discrete maten (figuur 1) ^1,2. Tapping mode AFM houdt de herhaalde oscillatie van de cantilever, die beeldvorming van relatief zachte biomaterialen, zoals DNA en eiwitten vergunningen. Een van de opmerkelijke voordelen van AFM ten opzichte van andere nanoschaal microscopische technieken is de relatieve aanpassingsvermogen aan de individuele eiwitten en macromoleculaire complexen te visualiseren in waterige buffers, waaronder bijna-fysiologische gebufferde omstandigheden, in real-time en zonder vlekken of coating van het monster af te beelden.

De methode hier gepresenteerde beschrijft de beeldvorming van DNA en een immunoadsorbed transcriptiefactor (dat wil zeggen de glucocorticoid receptor, GR) in gebufferde oplossing (figuur 2). Immunoadsorbed eiwitten en eiwitcomplexen kunnen worden gescheiden van de immunoadsorbing antilichaam-bead pellet door de concurrentie met het antilichaam epitoop en vervolgens belicht (figuur 2A). Dit maakt voor biochemische manipulatie van de biomoleculen van belang voorafgaand aan de beeldvorming. Eenmaal gezuiverd, kunnen DNA en eiwitten worden gemengd en de daaruit voortvloeiende interactie complex kan worden afgebeeld als goed. Binding van DNA naar mica is een tweewaardig kation ^3, zoals Ni ^{2 +} of Mg ^{2 +,} die kunnen worden toegevoegd nog om te proeven buffers te behouden proteïne activiteit. Met behulp van een soortgelijke aanpak heeft AFM is gebruikt om individuele enzymen, waaronder RNA-polymerase ⁴ en een reparatie-enzym ^5, gebonden aan de individuele DNA-strengen te visualiseren. Deze experimenten geven inzicht geeft in de eiwit-en DNA-eiwit biofysische interacties die plaatsvinden op het moleculaire niveau. Imaging individuele macromoleculaire deeltjes met AFM kan nuttig zijn voor het bepalen van deeltjes homogeniteit en voor het identificeren van de fysieke opstelling van de samenstellende componenten van de verbeelde deeltjes. Terwijl de huidige methode werd ontwikkeld voor visualisatie van GR-chaperonne-eiwit complexen ^1,2 en DNA-strengen aan de GR, die kan binden, kan het ruim te worden toegepast op de beeldvorming DNA en eiwit monsters van verschillende bronnen.

Protocol

1. Voorbereiden DNA en eiwit monsters af te beelden vrij van verontreinigingen

1. Isoleer biomoleculen te afgebeeld en plaats worden in een geschikte waterige buffer. Eiwitten worden afgebeeld kan worden gezuiverd met behulp van vloeistofchromatografie ^6, immunoadsorption gevolgd door verwijdering van het antilichaam en pellet ^1,2, of Profinity eXact loutering en tag verwijderen van ⁷ (Figuur 2A). Isoleer DNA-moleculen worden afgebeeld door Miniprep zuivering (Figuur 2B).
2. Bevestig de samenstelling en zuiverheid van eiwit monsters af te beelden met behulp van SDS-PAGE en western blotting. Voor DNA, bevestigen volgorde en zuiverheid door het invullen van een beperking verteren en agarosegelelektroforese.
3. Incubeer monsters in een AFM adsorptie buffer om de naleving van het monster te bevorderen mica. Voor eiwit monsters, kan 10 mM HEPES buffer worden gebruikt. Extra lage ionische sterkte zouten of andere co-factoren kunnen ook worden toegevoegd. Voor de DNA-monsters, onder meer een tweewaardige kationen (bijv. Mg ^{2 +} of Ni ^{2 +)} om adsorptie te bevorderen in de mica ondergrond. Een geschikte Mg ^{2 +-bevattende} buffer voor DNA is 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl ₂ ^3. Een alternatief Ni ^{2 +} buffer is 10 mM HEPES, pH 6,8, 10 mM NICL _2.
4. Verdun het monster tot een concentratie van 5 ng / ml in adsorptie buffer. Voorzichtig mengen. Op te slaan op het ijs, terwijl de microscoop wordt voorbereid.

2. Montage AFM probe

1. Doe de vloeibare cel sonde houder op de overeenkomstige cantilever installatie docking station.
2. Zoek de lange, dikke cantilever (hierna cantilever de 'B') van de scherpe nitride hendel (SNL) probe om te worden gebruikt voor de beeldvorming. Zorgvuldig over te dragen aan de vloeistof cel sonde houder, zodat de punt rechtop blijft. Technische noot: Men moet uiterst voorzichtig worden betaald, terwijl de sonde is in transit, het laten vallen van het van elke hoogte kan beschadigen of vernietigen van de cantilever en tip. Een microlever SNL (MSNL) probe kan gebruikt worden als een alternatief voor de SNL sonde.
3. Verwijder de sonde houder van het docking station en onderzoekt de cantilever onder een lichtmicroscoop om te verzekeren dat intact is en goed in de vloeistof cel sonde houder.
4. Verwijder voorzichtig de AFM kop van het instrument zwaluwstaart montage door het aandraaien van de gekartelde kop klem vast. Technische noot: Men moet uiterst voorzichtig worden betaald, terwijl het manipuleren van de AFM hoofd, zoals laten vallen van zelfs een korte afstand (bijvoorbeeld als niet correct in de zwaluwstaart assemblage) kan leiden tot aanzienlijke schade.
5. Keer de AFM hoofd en stevig de vloeistof cel sonde houder duwen op de vier pinnen aan de basis van de AFM hoofd. Voorzichtig terug te keren van de AFM kop in het instrument zwaluwstaart montage. Laat de gekartelde kop klemschroef aan de AFM kop vast in het instrument.

3. Lokaliseren cantilever tip, uitlijnen laser, en het aanpassen van fotodetector

1. Met behulp van de AFM instrument software, zoekt u de cantilever tip door het bewegen van de knoppen van de onboard lichtmicroscoop. Stel de verlichting van de microscoop indien nodig tip identificatie te verbeteren. Breng het eind van de cantilever punt in de nabijheid van het dradenkruis op het instrument software.
2. Breng de cantilever tip in beeld door het aanpassen van de pijlen omhoog en omlaag van de optiek controller op de software. Gebruik langzaam (S) of medium (M) snelheid, terwijl het aanpassen van de optiek.
3. Richt de laser op de cantilever tip behulp van de laser aanpassing knoppen. Verplaats de aanpassing knoppen tot de rode laser dot is in het witte verlichting ter plaatse. Trace langs de cantilever arm met behulp van een zig-zag patroon tot de laser is gepositioneerd op de cantilever tip. Bij het goed uitgelijnd, zal een sterke reflectie plek verschijnen in de voorruit van de AFM hoofd.
4. Midden van de fotodetector door aanpassing van de fotodetector knoppen op de AFM hoofd. Dit zal de lijn laserpunt in het vizier van de fotodetector display van het instrument software. De waargenomen signaal bedrag moet ongeveer 4-6.

4. Positionering AFM hoofd en tuning cantilever

1. Plaats een vers gesplitst blad van mica bevestigd aan een metalen exemplaar AFM schijf op de gemagnetiseerde monsterhouder de top van de AFM houder plaat. Deze opstelling zal gebruikt worden om de AFM het hoofd staat voorafgaand aan de beeldvorming van het DNA of eiwit monster bereid in stap 1.
   1. Technische noot: De gemagnetiseerd sample houder en vloeibare cel sonde houder zijn dikker dan andere monster bevestiging mechanismen en de meetpennen. Als er momenteel onvoldoende ruimte tussen de mica-sample houder montage en AFM hoofd, beweeg de AFM hoofd door het selecteren van de te trekken pictogram op het instrument software meerdere malen.
2. Draai de AFM houder plaat, zodat het monster disc is geplaatst voor de eerste beeldvorming. Zorg ervoor dat de mica ondergrond in het midden onder de AFM hoofd.
3. Verplaats de AFM hoofd naar beneden in de richting van deoppervlak van het mica-monster disc met de focus oppervlak controle van het instrument software. Selecteer het medium (M) snelheid op de Z-motor, en verder richting het oppervlak totdat de AFM hoofd is ongeveer 2 mm boven de mica. Op dit moment overschakelen naar het gebruik van de langzame (S) Z snelheid van de motor om de abrupte contact tussen de sonde en het oppervlak (aangeduid als crashen de tip) te voorkomen.
4. Ga verder met de sonde dichter bij de mica ondergrond tot verschillende functies op het mica oppervlak of de tip reflectie zijn in focus. Schakelen tussen oppervlak en reflectie tip focale vliegtuigen met behulp van de "focus op:" icoon van het instrument software.
5. Selecteer de melodie icoon van het instrument software en afstemmen van de cantilever. De resonantiefrequentie van de aanbevolen SNL en MSNL cantilever sondes is 20 tot 60 kHz. Selecteer een offset 5% piek. Technische noot: Adequate cantilever tuning is essentieel voor een adequaat monster beeldvorming.

5. Imaging mica monster oppervlak

1. Zet de sonde op het oppervlak van mica. Stel eerste scan grootte van 10 micrometer en scannen tarief op 1 Hz. Integrale versterking en proportionele versterking kan in eerste instantie worden ingesteld op 0,2 en 0,4, respectievelijk. Pas de winsten als nodig is om te achterhalen en traceren scans ongeveer overlappen. Verlaging van de amplitude setpoint zal de interactie tussen de sonde en de mica en zorgen voor betrokkenheid.
2. Vastleggen complete scan beelden van de 10 urn veld. Afname scanformaat tot 5, 1, en 0,5 micrometer en vangen volledige beelden van elk veld. Pas winsten en scan tarief als dat nodig is. Het vastleggen van beelden van de mica oppervlak biedt een basis voor vergelijking met de DNA-en eiwit-bevattende monsters.
3. Maak de sonde met een enkele klik op de los-pictogram op het instrument software.

6. Imaging biomoleculen van belang

1. Meng de DNA of eiwit monster bereid in stap 1 en voor te bereiden om het te laden op het verbeelde mica oppervlak. Meng 5 ul van de voorbereide monster met 45 ul van verse adsorptie buffer (eindmonster concentratie = 0,5 ug / ml).
2. Voeg voorzichtig 50 ul van de 0,5 ug / ml biomolecuul-bevattende oplossing direct op de mica oppervlak. Doe dit zonder het verplaatsen van de probe of AFM hoofd, en zorgen voor de oplossing van het monster (maar niet pipet tip) contact maakt met de sonde.
3. Pauze 5 minuten om de biomoleculen in de steekproef te houden aan de mica oppervlak.
4. Aan het einde van 5 minuten, pipet een extra 50 tot 100 ul van adsorptie buffer in de vloeistof cel sonde houder voorzichtig om niet aan de sonde, AFM hoofd, of mica met het pipet tip. Dit zal een meniscus en laat voor de AFM tapping mode imaging in vloeistof. Figuur 3 toont de definitieve regeling van de vloeistof cel, cantilever, monster, monster houder en meniscus.
5. Stel de fotodetector en opnieuw uitlijnen van de laser om de cantilever als dat nodig is. Technische noot: het bekijken van de sonde en laser uitlijning is te wijten aan het diffractiepatroon wordt veroorzaakt door de toevoeging van monster buffer in de sonde houder ingewikkeld. Handmatig opnieuw instellen van de cantilever, indien nodig.
6. Opnieuw inschakelen van de sonde met behulp van het instrument software. Pas verticale afbuiging, integrale versterking en staan ​​in verhouding krijgen als dat nodig is. Dit zal beginnen met het proces van re-imaging de sectie van mica onmiddellijk gescand voorafgaand aan de toevoeging van monster en foto's maken.
7. Verhoging van scanformaat (500 nm-10 micrometer) om gebieden van belang te identificeren. Zoom-in en verminderen scansnelheid tot 0,5 Hz tot beeldresolutie te verbeteren
8. Zodra beeldvorming is voltooid, los van de sonde door het selecteren van te trekken pictogram op het instrument software meerdere malen. Zorg voor voldoende ruimte tussen de AFM hoofd en monster schijf voor demontage van de vloeistof cel of monster disc.
9. Spoel de vloeistof cel sonde houder en monster-schijf met gedestilleerd water om zoutkristallen te voorkomen dat de vorming van de resterende adsorptie buffer verdampt. Droog met perslucht.

7. Representatieve resultaten:

Voorbeelden van AFM beelden worden weergegeven in figuur 4. Mica substraat (A) is een moleculair vlak oppervlak waarop DNA en eiwit kan adsorberen. Imaging mica voorafgaand aan de biomolecuul samples zorgt voor een negatieve controle en beoordeling van de beeldvorming lawaai. Het biedt ook een mate van zekerheid dat de cantilever goed is afgesteld en de daarop volgende monster imaging succesvol zal zijn. Double-stranded plasmide DNA (B, D), vermoedelijk supercoiled, is gemakkelijk geïdentificeerd door zijn asymmetrische uitstraling en uniforme storten op de eerder onopvallende mica ondergrond. Eiwit-complexen van discrete deeltjesgrootte (C, E) zijn ook uniek te onderscheiden van de mica ondergrond. Deeltjesgrootte verschillen duiden op steekproef heterogeniteit, en kan nuttig zijn om de onderlinge aanpassing van eiwitcomplex stoichiometrie of biochemische activiteit. De algemene diagonale vorm en de consequente oriëntatie van de proeiwit deeltjes waargenomen in Panel C is een imaging artefact, zoals eiwitten zou onverwacht gericht zijn op de mica substraat in een willekeurige manier. Mogelijke oorzaken van de waargenomen artefact is een lichamelijke afwijking of tip AFM beeldvorming bij te snel van een scan tarief. Terwijl de tip convolutie (in figuur 1B) voorkomt absolute lengte meting berekeningen in de x-en y-as, hoogtemeting (z-as) en de relatieve x-en y-metingen kunnen worden niettemin nuttig zijn voor het schatten van biofysische eigenschappen van de biomoleculen afgebeeld.

Figuur 1: Schematische voorstelling van tapping mode atomaire kracht microscopie (AFM). A, de microscoop. Aan het eind van de cantilever is een scherpe punt die oscilleert op en neer als het scant over het oppervlak van een mica substraat waarop biomoleculaire complexen adsorberen. Als de scanner beweegt in de x-en y-richting, is een laserstraal gereflecteerd vanaf de achterkant van de cantilever op een positie-gevoelige detector fotodiode om de verticale (z) afstand van de tip beweegt als het gaat over de biomoleculaire complexen zitten op de kaart mica. B. De vervorming van het beeld in de x-en y-richting veroorzaakt door tip convolutie. De nominale straal van een conventionele silicium nitride tip is groter dan de deeltjes af te beelden, en de rand van de tip contact op met de monster, zoals dit doorkruist het oppervlak. Tip convolutie resultaten in de verbeelde deeltjes verschijnen groter in de x-en y-richting, maar niet de z-richting. Dit effect kan geminimaliseerd worden door het gebruik van de tips met een kleinere nominale tip straal.

Figuur 2: Illustratie van immunoadsorbed eiwit-en DNA-monster voorbereiding. A, Vrijlating van immunoadsorbed GR • hsp70 eiwitcomplex van het monoklonale antilichaam (mAb)-proteïne A-Sepharose (PAS) pellet. Het incuberen van de immunopellet met een peptide met de mAb epitoop zal de release van de GR • hsp70 eiwitcomplex van de pellet, waardoor het complex worden verzameld uit de supernatant en gevisualiseerd door de AFM. B, Voorbereiding van DNA voor AFM beeldvorming vereist het gebruik van een tweewaardig kation adsorptie buffer. Het tweewaardige kation verhoogt de affiniteit van DNA voor de mica ondergrond.

Figuur 3: definitieve regeling van de AFM hoofd, vloeibare cel sonde houder, monster, preparaathouder, en buffer meniscus. A, Voorzichtigheid is geboden bij de nederlegging van monster en extra buffer op de mica ondergrond om fysiek contact tussen de pipet tip en AFM hoofd, vloeibare bellen, en mica ondergrond te voorkomen. B, Vergroting van A. De buffer meniscus uit het monster schijf overspant om de vloeistof cel sonde houder.

Figuur 4: Atomic force microfoto van mica substraat (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease plasmide DNA ⁸ (B, D), en GR • hsp70 eiwitcomplexen (C, E) in gebufferde oplossing. Mica dient als een controle afbeelding te vergelijken met de visualisaties van DNA en eiwitten. GR • Hsp70 eiwitcomplexen werden voorbereid door immunoadsorption van GR geprimed met Hsp70 en daarna vrijgelaten uit de antilichaam-kraal pellet met behulp van een mAb concurrerend antilichaam (in figuur 2A). DNA werd bereid door conventionele plasmide Miniprep. Panelen A, B en C zijn van een gelijkwaardige vergroting (schaal bars = 200 nm), net als de panelen D en E (schaal bars = 40 nm).

Discussion

AFM biedt een unieke microscopische techniek die in staat van beeldvorming individuele ongecoate biomoleculen in waterige en bijna-fysiologische gebufferde oplossingen in real-time. Dit maakt voor de visualisatie van individuele eiwitten en DNA-moleculen, evenals multiprotein complexen en eiwit-DNA complexen. Imaging macromoleculaire deeltjes met AFM kan nuttig zijn voor de beoordeling van sample homogeniteit en voor het identificeren van de fysieke opstelling van de samenstellende componenten van de waargenomen deeltjes. Deze benadering van het observeren van de individuele macromoleculaire deeltjes kunnen een nuttige aanvulling zijn om de conventionele biochemische technieken, zoals immunoprecipitatie testen, polyacrylamide gel elektroforese, en de size exclusion chromatografie, die een aanzienlijke summatieve gegevens die de 10 ³ -10 ¹¹ individuele biomoleculaire complexen van belang aanwezig te bieden in een monster.

Onderzoek naar multiprotein complex stoichiometrie, biomoleculaire interacties en co-factor eisen kunnen allemaal worden onderzocht met behulp van AFM. De methode hier gepresenteerde kan worden aangepast aan de specifieke biofysische vragen van belang tegemoet te komen. Bijvoorbeeld met behulp van een vloeibare cel sonde houder in staat om te wisselen buffer, is het mogelijk om co-factor test voor eiwit complex vorming. DNA-verzamelingen van eiwitten kunnen worden gevormd en gedissocieerd in near-real-time en zelfs terwijl in beeld wordt gebracht. DNA kan worden gegenereerd met specifieke sequenties van belang (bijvoorbeeld een vermoedelijk reactie elementen of nieuwe eiwit bindende sequentie), gemengd met de veronderstelde bindend eiwit, en belicht aan direct bewijs van de intermoleculaire interacties te bieden.

Tapping mode AFM beeldvorming is aanzienlijk minder gecompliceerd als droge monsters worden gebruikt in plaats van monsters in waterige oplossingen, en lineaire DNA stands en een gesloten kring DNA plasmiden zijn beide afgebeeld op deze manier ^3,9. De methode die hier wordt gepresenteerd maakt gebruik van samples in een gebufferde oplossingen om tot een meer fysiologisch imaging omgeving te bieden. Andere opmerkelijke methodes van beeldvorming eiwitten moet ook worden overwogen, waaronder nabije-veld microscopie infrarood ^10. Het complementaire gebruik van immunoadsorption in consort met AFM biedt een gelegenheid om een ​​groot aantal eiwit-complexen voor te bereiden, met behulp van gerenommeerde biochemische technieken, en ze vervolgens te visualiseren na ontslag uit het immunoadsorbing antilichaam-bead pellet. Zo heeft immunoadsorbed GR is getest op de associatie met de moleculaire chaperonne-eiwit hsp70 ¹ evenals de dyneine motor eiwit ² het gebruik van deze benadering om complexe grootte en de stoichiometrie te schatten. Deeltjesgrootte en biofysische eigenschappen (bijv. stijfheid) zijn nuttig in het vaststellen van de identiteit van de biomoleculen waargenomen in AFM afgebeeld monsters ^11,12. Het is ook mogelijk om biomolecuul identiteit te bevestigen door de toevoeging van een interactie biomolecuul (bijvoorbeeld een ligand of een monoklonaal antilichaam), dat zou binden aan zijn doel en veroorzaken een deeltjesgrootte te verhogen als het doel biomolecuul aanwezig is.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer
Dimensie 3100	Bruker	Dimensie 3100
Dimensie Fluid Cell	Bruker	DTFML-DD-HE
Sharp nitride hendel (SNL) siliciumnitride AFM probe	Bruker	SNL-10
Microlever scherpe nitride hendel (MSNL) siliciumnitride AFM probe	Bruker	MSNL-10
NanoScope AFM instrument software	Bruker	004-132-000
AFM metalen exemplaar schijven	Ted Pella	16208
Grade V1 Mica Discs, 12 mm	Ted Pella	50-12