Tracking Morfogenetische Tissue vervormingen in de vroege Chick Embryo

Samenvatting

Dit artikel beschrijft het oppervlak etikettering en de Ex ovo Weefselkweek in het begin van kippenembryo. Technieken ontvankelijk voor time-lapse helderveld, fluorescentie en optische coherentie tomografie beeldvorming worden gepresenteerd. Tracking oppervlak van etiketten met een hoge resolutie kunnen spatiotemporele kinematische grootheden als morfogenetische stammen (vervormingen) worden berekend in zowel twee en drie dimensies.

Samenvatting

Embryonale epitheel ondergaan complexe vervormingen (bijv. buigen, draaien, vouwen, en uitrekken) om de primitieve organen van het vroege embryo te vormen. Volgen de vaste markeringen op de oppervlakken van deze cellulaire bladen is een bekende methode voor het schatten van morfogenetische grootheden zoals groei, krimp, en afschuiving. Echter, niet alle oppervlakte-labeling technieken zijn makkelijk aan te passen aan conventionele beeldvorming en bezitten verschillende voordelen en beperkingen. Hier beschrijven we twee etikettering methoden en illustreren het nut van elke techniek. In de eerste methode, zijn honderden fluorescerende labels tegelijk toegepast op het embryo met behulp van magnetische ijzerdeeltjes. Deze labels worden vervolgens gebruikt om de hoeveelheid 2-D weefsel vervormingen tijdens de morfogenese. In de tweede methode, zijn polystyreen microsferen gebruikt als contrastmiddelen in niet-invasieve optische coherentie tomografie (OCT) beeldvorming naar 3-D weefsel vervormingen te volgen. Deze technieken zijn succesvolly geïmplementeerd in ons lab aan fysische mechanismen van de vroege hoofd vouwen, hart, en de ontwikkeling van de hersenen studythe, en moet worden aangepast aan een breed scala morfogenetische processen.

Protocol

1. Algemeen Experimentele Voorbereiding

1. Bereid weefselkweek medium in de laminaire stroming kap.
   1. Verdunnen Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (1 L fles met 4,5 g / L glucose, natrium-bicarbonaat, en L-glutamine). Voeg 10 ml penicilline / streptomycine / neomycine antibiotica.
   2. Verwijder de 100 ml DMEM met een steriele pipet en overdracht te vervangen door 100 ml chick serum.
   3. Aliquot de DMEM/10% kuiken serum / 1% antibiotica in steriele 15 ml conische flacons en bevriezen.
2. Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), aangevuld met calcium en magnesium. Meng 100 ml 10X PBS, 900 ml gedeïoniseerd water, en 1 ml van een geconcentreerde calcium-en magnesium-oplossing (100 mg / ml CaCl ₂ • 2H ₂ O, 100mg/ml MgCl ₂ • 6H ₂ O).
3. Incuberen eieren in een longitudinale oriëntatie op de gewenste, als gedefinieerd door de Hamburger en Hamilton ¹ (dwz 23-25 ​​uur voor HH fase 5, of 42-48 Uur voor HH stadia 11-12).
4. Verwijder embryo's uit het ei met behulp van het filter papieren drager methode.
   1. Crack de onderkant van het ei aan de kant van A150 mm petrischaal. Uit elkaar trekken van de shell van de bodem en leeg de inhoud van het ei in de schaal.
   2. Verwijder de dikkere, viskeuze eiwit uit het ei met behulp van stompe pincet.
   3. Snijd cirkels van Whatman # 2 filtreerpapier 2-3 cm. in diameter. Met behulp van een perforator, punch gaten in het midden van het filter papier. Plaats een van de filtreerpapier ringen op de dooier op een manier die het embryo zichtbaar door de centrale opening in de ring houdt.
   4. Snij je rond de buitendiameter van het filter papier met microscissors. Verwijder het papier uit de dooier met fijne pincet.
   5. Zachtjes spoelen het embryo in PBS het aanhangend dooier deeltjes te verwijderen. (HH5 embryo's kan nodig zijn om zo lang inwerken als 15-20 minuten om de resterende dooier te verwijderen). Verwijder het filterpapier montage van het bad en plaats het ventrale zijde naar boven in een35 mm cultuur schotel. Plaats een tweede filter papieren ring boven op de eerste, daartussen het embryo tussen de ringen. Leg een metalen ring rond de buitenkant van het filtreerpapier sandwich (≈ 1.5 - 2 cm diameter) van de embryo veilig te stellen.
   6. Dompel het embryo in kweekmedium. Controleer of de juiste morfologie en embryonale stadium met een helder veld microscoop.
5. Gebruik een pipet trekker om fijne tip glas naalden (1,5 mm binnendiameter) (Wereld precisie-instrumenten, Sarasota FL) voor te bereiden op latere weefsel dissecties en etikettering.

2. Dii Labeling van HH Fase 5 embryo's met behulp van magnetische ijzerdeeltjes

1. Voeg een paar druppels verzadigde Dii in alcohol om een ​​kleine hoeveelheid ijzerpoeder (ijzer gereduceerd, Mallinckrodt Baker, Inc, Phillipsburg, NJ) bij kamertemperatuur en laat drogen. (Dit veroorzaakt meestal de deeltjes om taart samen zodra de alcohol verdampt is.) Gebruik de punt van een getrokken micropipet te breken van de samengeklonterd ijzerdeeltjes,overbrengen naar een microcentrifugebuis, en spoel ze een paar keer en bedek met gedeïoniseerd water.
2. Te labelen ectodermale cellen in een embryo HH fase 5, plaats het geoogste embryo (dat wil zeggen, de hele filtreerpapier montage) dorsale zijde naar boven in een 35 mm cultuur schaal bedekt met een dikke laag van cultuur media en zet de schotel onder een dissectie microscoop. Gebruik een glazen naald om de vitelline membraan te verwijderen en de ectodermale cellen bloot te leggen. (Zorg ervoor dat niet doorboren embryo.)
3. Teken een kolom van gelabeld ijzer deeltjes (in gedemineraliseerd water) in een Pasteur pipet. Met behulp van de microscoop ontleden, dompel de pipetpunt onder het vloeistof oppervlak en positie net boven de embryo. Rollen van de pipet langzaam heen en weer tussen de vingertoppen, verdringen de deeltjes uit de pipiette en strooi ze over het embryo.
4. Zodra het embryo is bedekt met deeltjes, voorzichtig in een 37 ° C incubator gedurende ongeveer 10 minuten. Neem embryo uit de incubator eend gebruik van een sterke magneet om de deeltjes te verwijderen.
5. Gebruik een fluorescentiemicroscoop met bijgevoegde video-camera en geschikte filter instellingen om zowel helderveld en fluorescerende beelden van het embryo te verwerven, zoals weergegeven in Figuur 2A, B.
6. Let op het label dichtheid. Als er een dichtere verdeling is gewenst, gebruik maken van extra deeltjes (zoals hierboven beschreven) voor het embryo weer label en dienovereenkomstig uit te breiden van de incubatietijd. Als de labels zijn te dicht, voeg een kleine hoeveelheid van niet-gemerkt ijzerdeeltjes op de microcentrifugebuis gevuld met al gelabelde deeltjes en meng de buis inhoud. Herhaal de etikettering proces met een nieuwe embryo en weer Note-label dichtheid.

3. Polystyreen Microsphere Labeling voor Optical Coherence Tomography (OCT) Imaging van HH11-12 embryo's

1. Bereid een oplossing van zwarte 10 micrometer diameter van microsferen (Polysciences Inc, Warrington, PA) in PBS in een 35 mm petrischaal. (Beads moet groot genoeg zijn om het contrast te genereren voor oktoberbeeldvorming, maar klein genoeg zodat kraal grootte in de orde van de individuele cellen. Specifieke waarden zullen variëren afhankelijk van de resolutie van uw oktober systeem en de weefsels wordt onderzocht). Een druppel van de stockoplossing (2.6% vaste stoffen-latex) per ml PBS is over het algemeen voldoende. Trek deze oplossing in een 10cc spuit met behulp van een 22 gauge naald. Vortex de oplossing gedurende 30 seconden om een ​​uniforme kraal verdeling te verzekeren.
2. Bevel de toppen van je getrokken glas naalden met behulp van een computer de harde schijf ^2. Tip diameter moet groot genoeg zijn dat kralen kunnen passen door de opening, maar op hetzelfde moment, zo klein mogelijk te verwonden weefsel te minimaliseren tijdens de injectie.
3. Vul een schuine glazen naald met de kraal oplossing met de spuit. Licht flick de micropipet om ervoor te zorgen dat de oplossing is de tip bereikt.
4. Met behulp van een micromanipulator, plaatst u het glas naald in hetzelfde gezichtsveld als de embryo. Parels moeten vloeien uit de pipetpunt.
   1. Als er geen beads verlaat de micropipet, kan er een klomp. In dit geval, herhaal dan de stappen 3.2-3.4 met een nieuwe glazen naald.
   2. Als er te veel kralen wolk uw gezichtsveld, kan uw pipetpunt te breed. Herhaal de stappen 3.2-3.4 met een nieuwe pipet en een nieuwe embryo.
5. Plaats de pipet tip in het lumen van de hersenen buis. Zeker niet te doorboren het ventrale vloer van het weefsel. U ziet een voorbijgaande zwelling van het weefsel als kralen en vocht voer het lumen. Dit duidt op een succesvolle intubatie, nu, snel te verwijderen van de glazen naald.
6. Controleer of er voldoende kraal dichtheid in het binnenste lumen van de hersenen met behulp van een buis heldere veld microscoop. Laat de kralen genoegen nemen met 20 - 30 minuten alvorens tot Sect. 4.

4. Data Acquisition

* De volgende methoden zijn zeer geschikt voor de fluorescentie labeling techniek die hierboven beschreven. Echter, met de microsfeer labeling techniek kan kralen te verwijderen wanneer de overdracht van monsterstussen incubators en imaging systemen. In dit geval is het het beste om over te gaan tot en met 4.2 (die vermijdt sample beweging / agitatie in totaal) stap. In beide methoden, worden embryo's gekweekt, terwijl ondergedompeld in vloeibaar kweekmedium. Als het embryo niet volledig onder water (zoals het geval is met een aantal conventionele weefselkweek technieken), weefsel geometrie is sterk veranderd door abnormaal hoge oppervlaktespanning belastingen en druk distributies zal falen om nauwkeurig vast te leggen normale 3-D morfogenese ^{3, 4.} Bovendien, het onderdompelen van het weefsel voorkomt dat de heldere contrast waargenomen bij de vloeistof-gas-interface in oktober beeldvorming van verduisterende embryonale morfologie en marker coördinaten.

1. Embryo Cultuur (algemeen)
   1. Na de aankoop van uw eerste beelden (helderveld, fluorescentie, of LGO), gereed tot zeven 35 mm cultuur gerechten (met embryo's) in een 150 mm petrischaal en plaats de gehele montage in een klein plastic zakje. Voeg een paar druppels gedeïoniseerd water om de tas voor de bevochtigingen vul de zak met een 95% O ₂ / 5% CO ₂ mengsel. Plaats de embryo's in de incubator bij 37 ° C (Queue Stabiletherm, Asheville, NC) voor de gewenste tijd tot de volgende beeldvorming tijdpunt. Met behulp van deze methode, kunnen experimenten worden uitgevoerd op meerdere embryo's in de dezelfde dag.
2. Time-lapse cultuur (geautomatiseerd)
   1. Plaats uw label embryo's in een Delta T Dish (35 mm buitendiameter, 23 mm centrale opening met taps toelopende zijwanden, 0.17mm dik glas, Bioptechs, Butler, PA) met 1,2 ml van het kweekmedium.
   2. Bedek de schotel met een glazen deksel bewaard bij 37 ° C met behulp van een Bioptechs Delta T4 Cultuur Dish Controller (om condensvorming te voorkomen). Superfuse het embryo met een 95% O ₂ / 5% CO _2-gas mengsel geleverd door een mini-pomp Variable Flow-apparaat (Fisher Scientific). Voorafgaand aan het bereiken van het embryo, warmte en bevochtigen het gas door borrelen het door gedemineraliseerd water op een warme (<100 ° C) hete plaat. Een schema van deze experimentele set-up is weergegeven in figuur 1.
   3. Stel de software om automatisch beelden te verwerven op door de gebruiker bepaalde tijdstippen. Voor onze fluorescentie microscoop maken wij gebruik van Openlab software (PerkinElmer, Waltham, MA), en voor onze oktober-systeem, gebruiken we geveegd source Thorlabs software (Newton, NJ). Omdat deze methode is op dit moment alleen geschikt voor behandeling van een time-lapse experiment bij een tijd, is het vaak het beste om dit soort culturen te lopen 's nachts. Men zou kunnen omzeilen deze beperking door het installeren van een geautomatiseerd vertalen podium compatibel zijn met zowel de hardware en software van de imaging-systeem ^5.

5. Representatieve resultaten:

Labels worden automatisch bijgehouden (met behulp van Volocity, PerkinElmer) of handmatig (met behulp van de handleiding Tracking plugin in ImageJ, NIH) in elk experiment. In de fluorescerende labeling techniek, maken we gebruik van de Matlab routine Gridfit om 2D-oppervlakken passen door de marker coördinaten, waardoor morfogenetisch oppervlak stammen worden berekend ^{6, 7.} Standaard vergelijkingen worden gebruikt om deze waarden te transformeren in een relevante embryonale coördinatensysteem. Als alternatief kan in de LGO-techniek, oppervlakken zijn gegenereerd uit gesegmenteerde afbeelding volumes (verkregen via standaard software zoals Matlab of Caret ⁸⁾ en stammen worden berekend in de richting van de maximale of minimale kromming van het monster ^9.

We gebruikten onze ijzeren deeltje techniek te labelen en volgen de beweging van ectodermale cellen gedurende het hoofd vouwen vorming in het begin van de kippenembryo. Zoals weergegeven in figuur 2A, werden fluorescent gelabelde cellen verspreid over de hele embryo. Helderveld en fluorescerende beelden van het embryo werden gevangen genomen op verschillende tijdstippen tijdens de ex ovo cultuur. De bewegingen van de gevolgde labels (Fig. 2B, C) werden vervolgens gebruikt om de zich ontwikkelende morfogenetische stam uitkeringen tijdens de vorming van het hoofd vouwen (fig. 2D-F) te berekenen.

t "> Ook onze polystyreen microsfeer techniek werd gebruikt om weefsel te traceren in het midden van de achterhersenen grens van de vroege kuiken hersenen. Zoals weergegeven in figuur 3 BD, werden bead bewegingen bijgehouden voor 6 uur en stammen karakteriseren van weefsel vervorming in de lengte-en omtrek directions werden berekend op basis van marker-coördinaten. Deze methode is in staat de behandeling duidelijk 3-D vervormingen die de kralen hebben de neiging om zich aan alle kanten van de binnenste lumen van de hersenen (fig. 3A).

Figuur 1. Schematische van de set-up voor de time-lapse weefselkweek.

Figuur 2. Kwantificering van 2-D weefsel vervormingen in het begin van de kippenembryo met behulp van fluorescerende labels getraceerd. (A) Samengevoegd helderveld / tl-imago van de HH stadium 5 embryo na verwijdering van ijzer deeltjes. Dii-labeled ectodermale cellen (rood) zijn verdeeld over het hele embryo. (B, C) De beweging van gelabelde cellen werd gevolgd met behulp van ImageJ. Label verplaatsingen werden berekend in embryo coördinaten (X, Y). Merk op dat A en B zijn dezelfde afbeelding. (DF) Contour plots van de evoluerende longitudinale strain uitkeringen tijdens het hoofd vouwen formatie. Longitudinale Lagrange stammen waren ten opzichte berekend naar de derde fase 5 HH (dat wil zeggen, A en B) na (D) 75 min, (E) 120 min, en (F) 165 min van incubatie. Deze stammen karakteriseren de lengte veranderingen van lijnelementen oorspronkelijk georiënteerd langs de Y-as (in de fase 5 embryo). Verdere details over het gebruik van bijgehouden label coördinaten te berekenen morfogenetische stammen kunnen worden gevonden in Filas et al.. (2007) ⁶ en Varner et al.. (2010) ^7. Merk op dat C en F zijn dezelfde afbeelding. Schaalbalk = 500 pm.

Figuur 3. Kwantificering van 3-D weefsel deformations in het begin van kuiken hersenen. (A) Polystyreen microsferen die voldoen aan de dorsale (zwarte pijl) en ventrale (witte pijl) kanten van de hersenen buis zijn gemakkelijk te onderscheiden van de omringende weefsels in transversale section.Ventral uitzicht oktober reconstructies tonen microsfeer locaties in de buurt van de mid-achterhersenen grens bij (B) UU12 en na (C) 6 uur van incubatie (M: middenhersenen, H: achterhersenen). Verschillende groepen van de kralen zijn geschetst om de algemene vervorming van het weefsel te markeren. (D) Longitudinale (E _zz) en omtrek (E _θθ) Lagrange stammen werden berekend op basis van deze vervormingen. Positieve en negatieve longitudinale omtrek stammen in het midden van de achterhersenen grens overeen met een axiale verlenging en verkorting omtrek van deze streek tijdens de cultuur. Verdere details over het berekenen van morfogenetische stammen voor complexe oppervlakken tijdens de morfogenese kan worden gevonden in Filas et al.. (2008) ^9. Schaalbalk = 200 micrometer.

Discussie

Twee weefsel labeling technieken worden gepresenteerd voor de ex ovo cultuur van de vroege kippenembryo's. De eerste maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen lipofiele geleverd via magnetische ijzerdeeltjes gelijktijdig label van honderden cellen. Echter, deze methode is momenteel niet compatibel met optische coherentie tomografie, als fluorescerende kleurstoffen vertonen over het algemeen weinig contrast van de omringende weefsels met behulp van ^{10 oktober.} Daarom tonen we een alternatieve ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal / Reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
DMEM - hoge glucose-	Sigma-Aldrich	D5796
Penicilline / streptomycine / Neomycine	Sigma-Aldrich	P4083
Kip Serum	Invitrogen	16110-082
Dulbecco's fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing	Sigma-Aldrich	D1408	10X
Whatman # 2 Filter Paper	Whatman papier	1002 090	90mm diameter
Glas Micropipetten	Wereld PrecisionInstrumenten (WPI)	TW150-6	1,5 mm binnendiameter
Dii	Invitrogen	D-282
Minder ijzer	Mallinckrodt Baker Inc	5320
10 micrometer Diameter microsferen (zwart)	Polysciences Inc	24294
Delta T Dish (voor time-lapse cultuur)	Bioptechs	04200415B	0.17mm dik, zwart
Delta T4 Cultuur Dish Controller	Bioptechs	0420-4-03
Mini-Pomp Variable Flow Device	Fisher Scientific