Beschrijven we een efficiënte methode om enkelstrengs DNA, double-stranded DNA-en RNA-moleculen te scheiden van het milieu virale gemeenschappen. Nucleïnezuren worden gefractioneerd met behulp van hydroxyapatiet chromatografie met toenemende concentraties van fosfaat-bevattende buffers. Deze methode laat de isolatie van alle virale nucleïnezuur types van het milieu monsters.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Virussen, in het bijzonder bacteriofagen (fagen) zijn de meest talrijke biologische entiteiten op Aarde 1,2. Virussen moduleren gastheercel overvloed en diversiteit een bijdrage leveren aan de recycling van voedingsstoffen, veranderen gastheercel fenotype, en beïnvloedt de ontwikkeling van zowel de gastheercel en virale gemeenschappen via de laterale overdracht van genen 3. Talrijke studies hebben gewezen op de onthutsend genetische diversiteit van virussen en hun functionele mogelijkheden in een verscheidenheid van natuurlijke omgevingen.
Metagenomic technieken zijn gebruikt om de taxonomische diversiteit en functionele mogelijkheden van complexe virale assemblages, waarvan de leden bevatten enkelstrengs DNA (ssDNA), dubbelstrengs DNA (dsDNA) en RNA genotypen 4-9 te bestuderen. Huidige bibliotheek bouw-protocollen gebruikt om de milieu-DNA bevatten of RNA-bevattende virussen studie vereisen een eerste nuclease behandeling om te verwijderen nontargeted sjablonen 10. Echter, een beter begrip van het collectieve gen complement van het virus gemeenschap en virus diversiteit vraagt om kennis van alle leden, ongeacht genoom samenstelling. Fractionering van gezuiverd nucleïnezuur subtypes biedt een effectief mechanisme om virale assemblages bestuderen zonder in te boeten een subset van de genetische van de gemeenschap handtekening.
Hydroxyapatiet, een kristallijne vorm van calciumfosfaat, is werkzaam in de scheiding van nucleïnezuren, evenals eiwitten en microben, sinds de jaren 1960 11. Door gebruik te maken van de lading interactie tussen de positief geladen Ca 2 + ionen van het hydroxyapatiet en de negatief geladen fosfaat ruggengraat van het nucleïnezuur subtypen, is het mogelijk om bij voorkeur elueren elk nucleïnezuur subtype onafhankelijk van de anderen. We hebben onlangs in dienst van deze strategie om zelfstandig te fractioneren van de genomen van ssDNA, dsDNA-en RNA-bevattende virussen ter voorbereiding van de DNA-sequencing 12. Hier presenteren we een methode voor de fractionering en herstel van de ssDNA, dsDNA-en RNA-virale nucleïnezuren uit gemengde virale assemblages met behulp van hydroxyapatiet chromotografie.
Protocol
1. Voorbereiding van de Solutions
Voor het uitvoeren van hydroxyapatiet chromatografie, moet fosfaat buffers worden voorbereid en het hydroxyapatiet moeten goed gehydrateerd.
- 1M-fosfaat-oplossing, pH 6.8: In een 1 liter fles 119.98g van natrium monobasisch oplossen in 1L steriele, DEPC behandeld H 2 O. Bereid een 1M dibasisch oplossing in een 1L fles door het oplossen van 141.96g van dibasisch in 1L van steriele, DEPC behandeld H 2 O. Combineer de mono-en di-oplossingen bij een verhouding van 1:1. Plaats kolf op een bord roer en meng met behulp van een magnetische roerstaaf. Pas de pH op 6,8 door toevoegin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hydroxyapatiet chromatografie methodiek hier wordt gepresenteerd is een zeer efficiënte en robuuste hulpmiddel voor de fractionering van nucleïnezuren uit gemengde virale assemblages, wanneer het doel is het bestuderen van de totale nucleïnezuur samenstelling van de gemeenschap. In het algemeen zal ssDNA, RNA en dsDNA elueren uit de kolom pho fosfaatbuffer concentraties hoger dan ongeveer ~ 0en 0,40 m respectievelijk. Echter, elke bereiding van hydroxyapatiet hebben een iets andere samenstelling en elutiepro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door de Office of Science (BER), US Department of Energy, samenwerkingsovereenkomst nee. De-FC02-02ER63453, Microbiële het genoom van de National Science Foundation Sequencing Program (award nummers 0626826 en 0731916). Wij danken John Glass voor zijn technische expertise en advies en K. Eric Wommack voor zijn hulp bij het milieu monstername.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materiaal Naam | Vennootschap | Catalogus Nummer | Catalogus Nummer |
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID-pakket / 2 |
| Hydroxyapatiet | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Natriumfosfaat, monobasisch | VWR | VW1497-01 | Monohydraat, Crystal 500g |
| Natriumfosfaat, tweebasisch | VWR | VW1496-01 | Watervrij, Poeder 500g |
| DEPC behandeld Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS oplossing | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0,5 M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8,0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serologische pippette | VWR | 89130-884 | Polystyreen, Steriel |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR | 21008-936 | 15ml, Steriel |
| Fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1 v / v / v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugaal Device | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membraan |
| 20X TE-buffer, RNase vrij | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
Referenties
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
