Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen

Samenvatting

Een eenvoudige en handige methode om de mate van gap junction tracer koppeling tussen het netvlies neuronen te bepalen is beschreven. Deze techniek laat toe om de functie van de elektrische synapsen tussen neuronen in de retina intact te onderzoeken onder verschillende belichting omstandigheden en op verschillende tijdstippen van de dag en nacht.

Samenvatting

Naast de chemische synaptische transmissie, kunnen neuronen die zijn verbonden door gap junctions ook snel te communiceren via elektrische synaptische transmissie. Steeds meer aanwijzingen geeft aan dat gap junctions niet alleen toe elektrische stroom en synchrone activiteit tussen onderling verbonden of gekoppeld cellen, maar dat de kracht en effectiviteit van de elektrische communicatie tussen de gekoppelde cellen kunnen worden gemoduleerd voor een groot deel ^1,2. Daarnaast is de grote interne diameter (~ 1.2 nm) van de vele gap junction kanalen vergunningen niet alleen elektrische stroom, maar ook de verspreiding van intracellulaire signaalmoleculen en kleine metabolieten tussen de cellen onderling verbonden, zodat gap junctions kan ook bemiddelen metabole en chemische communicatie . De kracht van gap junctions de communicatie tussen neuronen en de modulatie door neurotransmitters en andere factoren kan worden bestudeerd door gelijktijdig elektrisch gekoppeld opname van cellen en door het vaststellen van tHij mate van verspreiding van de tracer moleculen, die gap junction doorlaatbaar, maar niet doorlaatbaar membraan, na iontoforetische injectie in enkele cellen. Echter, kunnen deze procedures worden uiterst moeilijk uit te voeren op de neuronen met kleine somata in intacte zenuwweefsel.

Talrijke studies op elektrische synapsen en de modulatie van elektrische communicatie zijn uitgevoerd in de gewervelde netvlies, omdat elk van de vijf netvlies neuron soorten wordt elektrisch verbonden met gap junctions ^3,4. Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat het circadiane (24-uurs) klok in het netvlies en de veranderingen in het licht stimulatie gap junction koppeling ^3-8 te reguleren. Zo heeft recent werk laten zien dat de retinale circadiane klok gap junction koppeling tussen de staafjes en kegeltjes lichtgevoelige cellen afneemt gedurende de dag door een verhoging van dopamine D2 receptor activering, en dramatisch verhoogt rod-cone koppeling 's nachts door het verminderen van D2-receptor activering Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het bepalen van de omvang van gap junction tracer koppeling tussen het netvlies neuronen onder verschillende belichting omstandigheden en op verschillende tijdstippen van de dag en nacht. Deze cut-loading techniek is een modificatie van schrapen laden ^9-12, die gebaseerd is op het laden van kleurstof en verspreiding via een open gap junction kanalen. Schraap het laden werkt goed in gekweekte cellen, maar niet in dikke plakken, zoals intact netvlies. De cut-loading techniek is gebruikt om fotoreceptor koppeling in intacte vissen en zoogdieren netvlies ^{7, 8,13} studie, en kan gebruikt worden om te studeren koppeling tussenandere retinale neuronen, zoals hier beschreven.

Protocol

1. Intact neurale netvlies voorbereidingen voor goudvissen, muizen en konijnen

1. Voer de volgende stappen, waaronder die worden beschreven in "2) Cut-loading," onder constante omgevingstemperatuur (achtergrond) verlichting. Houdt u er rekening mee dat voor de toepassing van dit protocol, de procedures worden beschreven als uitgevoerd in constante duisternis (dwz onder zeer donkere (dwz "scotopic") voorwaarden ≤ 0,0001 lux) met behulp van infrarood nachtzicht bril, maar ook andere hogere intensiteit niveaus van constante omgevingstemperatuur verlichting kunnen worden in plaats daarvan gebruikt om het effect van de andere niveaus van ambient verlichting op gap junction tracer koppeling te bepalen.
2. Dark-aanpassen van de proefdieren (goudvis, muis of konijn) gedurende minstens een uur voor de operatie.
3. Zoals eerder beschreven ^7, diep verdoven goudvis door ze te plaatsen in tricaïne methaansulfonaat (MS222, 150 mg / L van gebufferd (natrium-bicarbonaat-bevattende) aquarium water), en diep muizen verdoven met ketamine (100 mg/ Kg, ip) en rompun (10 mg / kg, ip). Diep verdoven konijnen met urethaan (oplaaddosis: 2,0 g / kg, ip) en ook gebruik maken van lokale verdoving intraorbital (2% Xylocaine), zoals eerder beschreven ^8. Alle experimentele procedures met betrekking tot de zorg en het gebruik van dieren moet worden uitgevoerd in overeenstemming met federale richtlijnen en moeten worden beoordeeld en goedgekeurd door de lokale universiteit dier zorg en gebruik van de commissies. (Opmerking:. In de experimenten hier beschreven, alle experimentele procedures met betrekking tot de zorg en het gebruik van vissen, muizen en konijnen werden uitgevoerd in overeenstemming met NIH richtlijnen en werden beoordeeld en goedgekeurd door de Ohio State University Institutional Animal Care en gebruik Comite)
4. Voor vissen, muizen en konijnen, na enucleatie, verwijder het voorste gedeelte van elk oogbol. Plaats dan een stukje filtreerpapier op de top van het achterste deel van het oog en keer het filter met het oog, zodat het filter papier onder het achterste deel van het oog. Dan, met een fijnpincet ontleden de intacte neurale netvlies van de achterste deel van het oog door zachtjes afpellen van het pigment epitheel / choroidea / sclera, die verbonden zijn aan elkaar, van de neurale netvlies, die is bevestigd aan de filter papier. Dit gebeurt, snijd de oogzenuw met behulp van fijne verende schaar. De neurale netvlies, gericht fotoreceptor-kant naar boven, moet nu worden bevestigd aan de filter papier en gescheiden van de rest van het oog.

2. Cut-loading

1. Dompel het netvlies in de oplossing zuurstofrijk Ringer's (tabel 1) in een 6-wells plaat (~ 5 ml / putje) gedurende 30 min onder constante omgevingstemperatuur (achtergrond) verlichting (bijv. onder zeer donkere (dwz "scotopic") voorwaarden) met of zonder een test drug. Onderhouden vis netvliezen in zuurstofrijk (5% CO ₂ / 95% O ₂₎ bicarbonaat-based Ringer's bij 22 ° C door het afdichten van de 6-well plaat met parafilm en onderhouden van muis en konijn netvliezen bij 36 ° C in een 5% CO ₂ / 95% O _{2 incubator. Wanneer een test geneesmiddel wordt gebruikt, moet aanwezig zijn bij alle volgende stappen tot fixatie}
2. Bereid de tracer oplossing (meestal 100 pi), door het oplossen van neurobiotin (0,5%), een gebiotinyleerd molecuul, in Ringer-oplossing direct vóór dwars door het netvlies. Merk op dat 0,5% rhodamine dextran (hoog (> 10.000) MW) kan worden toegevoegd aan de oplossing. Door zijn hoog moleculair gewicht, is rhodamine dextran niet over gap junctions en alleen etiketten cellen die zijn beschadigd door de snede. Zoals getoond in Fig. 3, dit is een handige manier om cellen die zich ophopen neurobiotin, omdat ze gewond zijn geraakt, van degenen die de tracer verzameld hebben door diffusie door gap junctions te onderscheiden.
3. Plaats de neurobiotin oplossing op een glas (of plastic) petrischaal, tikt u op het filtreerpapier, waarbij het netvlies is bevestigd, op een papieren handdoek om het overtollige Ringer te verwijderen, een scheermesje (of een ander scherp mes), duik in de neurobiotin oplossing en den maak een radiaal snijden door het netvlies en de filter papier. Indien gewenst, kan afstandhouders worden gebruikt, zodat de snede wordt gemaakt door het netvlies, maar niet de filtreerpapier. De snede moet worden gericht loodrecht op het netvlies oppervlak. Dompel het scheermes in de neurobiotin oplossing weer en snijd het netvlies een tweede keer. Herhaal dit tot 4 sneden per netvlies (zie figuur 1.). Gebruik een dissectie microscoop bij het maken van scheermes snijdt door de muis en andere kleine netvliezen.
4. Zoals getoond in Fig. 1, dompel het netvlies weer in medium verse Ringer's, met of zonder te testen geneesmiddel, met behulp van een 6-plaat goed (5 ml Ringer / well). Incubeer het netvlies gedurende 15 minuten om te zorgen voor het laden en diffusie.
5. Was drie keer voor 5 min elk met vers Ringer's medium met of zonder test drug.
6. Bevestig het netvlies met 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PBS, pH 7,4) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
7. 'S nachts wassen met 0,1 M PBS bij 4 ° C.
8. De volgende dag, reageer wet 2% streptavidine-Alexa 488 (eindconcentratie 10 pg / ml) in 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, en overnacht bij 4 ° C te houden
9. Was drie keer voor 10 minuten elk met 0,1 M PBS bij RT
10. In PBS, het netvlies los van het filter papier en daarna, met een fijn penseel, plaats het netvlies, gericht fotoreceptor-kant naar boven, op een dia.
11. Voorzichtig monteren met Vectashield montage medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
12. Foto's maken met een laser scanning confocale microscoop (bijvoorbeeld Zeiss 510 META) op dezelfde vergroting, resolutie en instellingen voor elke experimentele conditie, zodat u de effecten van de verschillende experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld te testen drugs verlichting voorwaarden) te vergelijken op de mate van gap junction tracer koppeling (Fig. 2A-C en Fig. 4A-C). Hoewel een enkel beeld kan bevatten alle van de gemerkte cellen, is het aanbevolen dat u een z-stack van de oppervlakte van belang te verzamelen en storten het in een enkelbeeld.

3. Kwantificering van de tracer koppeling met behulp van ImageJ

1. In de LSM image browser, de afbeelding te openen, klik op Exporteren en sla de foto als een TIF-16 bit NIET gecomprimeerd bestand. Schaalbalk moeten worden opgenomen in deze TIF-beeld.
2. Met behulp van NIH ImageJ software, meten fluorescentie-intensiteit van de Alexa-488-gelabelde neurobiotin uit lage-vergroting beelden van de hele-mount netvlies. Open het TIF-bestand met behulp ImageJ-software en vervolgens trek een rechte lijn die overeenkomt met de schaal bar. Ga naar ANALYSEREN, SET SCALE en voer de bekende afstand en de eenheid van lengte, klik op OK. Nu meetresultaten kunnen worden gepresenteerd in gekalibreerde eenheden, zoals millimeters.
3. Selecteer het gebied van belang het gebruik van de rechthoekige selectie tool. De piek van de fluorescentie moet worden geplaatst aan de linker rand van uw selectie. Zorg ervoor dat er geen fluorescentie-signaal in de buurt van de rechter rand. Zo niet, draai de actieve afbeelding (IMAGE, en draai).
4. KlikkenANALYSE en PLOT PROFIEL. U ziet nu een curve met een exponentiële verval van links naar rechts.
5. Klik op COPY in het pop-up venster en plak deze in EXCEL. Nu zie je twee kolommen met de afstand van de snede (linker kolom) en de fluorescentie-intensiteit als functie van de afstand van de cut (rechter kolom).
6. Verdeel elke rauwe fluorescentie-waarde door de maximale fluorescentie waarde aan de relatieve fluorescentie-intensiteit te verkrijgen.
7. Kopieer twee kolommen die overeenkomen met de afstand van de cut (X) en de relatieve fluorescentie-intensiteit (Y), en plak ze in Origin software.
8. Fit met de exponentieel verval # 1 functie (fig. 2D en 4D figuur.), Die in de vorm:
   Y = Y ₀ + Y _max * exp ^{(-x / λ)}
   waarbij Y is de relatieve fluorescentie-intensiteit, Y _o is de achtergrond fluorescentie, Y _max is de maximale relatieve fluorescentie, λ is de space (lengte) constant, en x is de afstand van de snede.
9. Vergelijk de ruimte constant (λ)-waarden bij verschillende experimentele condities met behulp van de t-test of ANOVA (fig. 2E en Fig. 4E). Merk op dat alternatieve technieken voor kwantificering zijn beschreven door anderen ^13,14.

4. Representatieve resultaten

Representatieve voorbeelden van fotoreceptorcel tracer koppeling, zoals bepaald door cut-laden worden gepresenteerd in de figuren 2 en 3 (vis) en Figuur 4 (konijn). Confocale beelden werden genomen met dezelfde instellingen te vergelijken (Fig. 2A-C en Fig. 4A-C) en de fluorescentie-intensiteit is uitgezet als functie van de afstand van de gesneden en gemonteerd door de exponentiële functie die in nummer 3.8 boven (fig. 2D en Fig. 4D). Ruimte constante waarden voor elke conditieworden getoond in de figuren 2E en 4E, illustreren dat de mate van gap junction tracer koppeling kan worden gekwantificeerd aan de hand van de cut-loading techniek. Daarnaast zijn de resultaten zeer reproduceerbaar. Gebruik van de cut-loading techniek als een middel om het kwantificeren van de omvang van de gap junction tracer koppeling wordt ook bevestigd door de bevinding dat fluorescentie-intensiteit exponentieel afneemt als een functie van de afstand van de snede in alle onderzochte gevallen ^7,8 (zie ook Fig. 2D en 4D hier), wat aangeeft dat neurobiotin de fotoreceptoren ingevoerd via het scheermes geknipt en niet uit andere retinale sites. Bovendien is de kwalitatief vergelijkbaar dag / nacht verschil in fotoreceptorcel tracer koppeling waargenomen in goudvissen met de tracer injecties in enkele kegels en met cut-loading ⁷ onderbouwt cut-laden als een relatief nauwkeurig middel van het meten van de omvang van fotoreceptor koppeling.

De cut-loading techniek kan ook worden gebruikt om andere vormen van elektrische synapsen in het netvlies te onderzoeken. Bijvoorbeeld, Figuur 5 laat zien dat konijn A-type (Fig. 5A) en B-type (Fig. 5B) horizontale cellen vertonen homologe tracer koppeling volgende cut-laden en verspreiding van neurobiotin onder donker aangepaste omstandigheden.

Samenstelling	Vis	Muis	Konijn
NaCl	130	120	117
NaHCO 3	20	25	30
NaH 2 PO 4	-	1	0.5
KCL	2.5	5	3.1
Glucose	10	10	10
MgCl 2	1	-	-
MgSO 4-7H 2 O	-	1	1.2
Glutamine	-	0.1	0.1
CaCl 2	0.7	2	2

Tabel 1: Samenstelling van oplossingen van de Ringer's voor goudvissen, muis en konijn netvliezen. De concentraties zijn weergegeven in mM. De Ringer-oplossingen zijn geborreld met 5% CO ₂ / 95% O ₂ en gehandhaafd op 22 ° C (vis) of 36 ° C (zoogdieren). "-": Niet in de Ringer voor deze soort.

Figuur 1:. Flow grafiek met de cut-loading procedure. Na isolatie of de intacte neurale netvlies, waren verschillende radiale sneden gemaakt door een mes dat voor het eerst werd gedompeld in 0,5% neurobiotin oplossing. Het netvlies werd geïncubeerd gedurende tracer laden en diffusie, en vervolgens gewassen voor fixatie met 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (PB). Tracer koppeling werd onderzocht met behulp van streptavidine-geconjugeerde Alexa-488.

Figuur 2. Dag-nacht verschil in fotoreceptor tracer koppeling in goudvis is onthuld door de cut-loading techniek. Fotoreceptorcel gap junction neurobiotin tracer koppeling werd uitgebreid in de nacht (B) en in de dagen na toepassing van spiperone (10 uM), een selectieve dopamine D _2-receptor antagonist (C), maar niet in de dag onder controle condities (A). D) De genormaliseerde relatieve fluorescentie-intensiteit als functie van de afstand van de bezuinigingen (aangegeven met pijlen in AC). E) Ruimte constant valUES verkregen uit de gegevens in D en andere experimenten (n = 4). *** P <0.001.

Figuur 3. Een representatief voorbeeld met fluorescentie in de fotoreceptorcel laag van een donker aangepaste goudvis netvlies 's nachts na cut-laden met een oplossing van zowel de neurobiotin en rhodamine dextran. Rhodamine dextran (aangegeven in rood), die niet verspreiden door middel van open gap junction kanalen vanwege het hoge moleculaire gewicht (> 10.000 MW), alleen gelabelde cellen in de buurt van de snede. In tegenstelling, kunnen neurobiotin (aangegeven in groen) verspreid via gap junctions en gezien te worden in fotoreceptorcellen ver van de snede. De locatie van de snede wordt aangegeven door de pijl in elk paneel. Schaal bar: 200 micrometer.

Figuur 4. Dag-nacht verschillenHet verschil in fotoreceptor tracer koppeling in konijnen netvlies is onthuld door de cut-loading techniek. Fotoreceptorcel gap junction neurobiotin tracer koppeling werd uitgebreid in de nacht (B) en in de dagen na toepassing van spiperone (10 uM) (C), maar niet in de dag onder controle condities (A). In AC, loodrecht uitzicht op de 3D-reconstructie van konijn fotoreceptoren dicht bij de snede weergegeven. D) De genormaliseerde relatieve fluorescentie-intensiteit als functie van de afstand tot de bezuinigingen. E) Ruimte constante waarden verkregen uit de gegevens in D en andere experimenten (n = 3). *** P <0.001.

Figuur 5. Cut-loading blijkt dat donker aangepaste konijn horizontale cellen zijn tracer gekoppeld. Zowel de A-type (A) en B-type (B) horizontale cellen in donker aangepaste konijn netvlies tentoongesteld homologe neurobiotin tracer koppeling.

Discussie

De cut-loading hier beschreven methode is een nuttige en eenvoudige techniek om de omvang van de gap junction tracer koppeling tussen het netvlies neuronen onder verschillende belichting omstandigheden en op verschillende tijdstippen van de dag en nacht te bepalen. Voordelen van deze techniek zijn de mogelijkheid om de mate van gap junction tracer koppeling tussen de neuronen in het netvlies intact weefsel te kwantificeren onder verschillende omstandigheden tijdens de verlichting dag en nacht en om dat te doen voor gekoppelde neuronen die met een kleine diameter somata hebben. Beperkingen van de techniek in de studie van gap junctions in intact weefsel vallen in twee algemene categorieën. Ten eerste kan tracer diffusie door middel van open gap junctions zijn relatief moeilijk waar te nemen als gevolg van een) de kleine diameter van of de lading in verband met de open kanalen en b) de relatieve hoeveelheden van gekoppelde cellulaire compartimenten ^1,14,15. Dat wil zeggen, tracer diffusie van een kleine cel naar een grotere cel of een groep van gekoppelde cellen, compared naar tracer diffusie van een grotere cel naar een kleinere cel, kan moeilijker te detecteren, omdat tracer verdunning. Ten tweede, onder bepaalde fysiologische omstandigheden, kan de omvang van de tracer diffusie door gap junctions in intact weefsel niet nauwkeurig overeen met de sterkte van de gap junctions geleiding te wijten aan verschillen in de geleiding van kleine elektrische stroom-dragende ionen, in vergelijking met de doorlaatbaarheid van relatief grote tracer moleculen ^1,14,15. In het algemeen, het bewijs van tracer-koppeling wijst er sterk op de aanwezigheid van werkende, open gap junction kanalen, maar onder bepaalde fysiologische omstandigheden, tracer diffusie kan niet plaatsvinden of worden nageleefd, ook al is elektrofysiologisch opnames van de aanwezigheid van werkende, open gap junctions suggereren.

Het lijkt waarschijnlijk dat de cut-loading techniek ook kan worden gebruikt om de mate van gap junction tracer koppeling te onderzoeken tussen de neuronen in intact weefsel uit andere regio's van het centrale zenuwstelsel systeemteem.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Tricaïne methaan sulfonaat (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040	150 mg / L van gebufferd aquarium water
Urethaan	Sigma-Aldrich	U2500	2 g / dosis kgloading
Dual Tube Night Vision Goggle	Night Optics USA	D-221
Filtreerpapier, Grade nr. 4	Whatman papier	1004-090
Fijn Tang, Dumont nr. 5, Biologie, 11 cm lang	Fine Science Tools	11295-10
Fijn Schaar, lente-loaded, 8 mm zaagblad, recht	Fine Science Tools	15025-10
Neurobiotin	Vector	SP-1120	0,5%
Streptavidine-geconjugeerde Alexa 488	Invitrogen	S11223	2%
Dextran rhodamine (hoog (> 10.000) MW)	Invitrogen	D1817	0,5%
Vectashield afdekmedium	Vector	H-1000
Zeiss 510 META laser scanning confocale microscoop	Carl Zeiss, Inc
LSM-5 Image Browser 3,2,0,115	Carl Zeiss, Inc
ImageJ Software	NIH
OriginPro 8.0	OriginLab Corp