De dissectie techniek illustreert enucleatie van de muis oog voor weefsel fixatie te fenotypering presteren in high-throughput-schermen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Mouse Eye Enucleatie voor Remote High-throughput Fenotypering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De muis is een belangrijke eye genetisch model voor de studie van menselijke translationele oogziektes. Blinding ziekten bij de mens, zoals maculadegeneratie, fotoreceptor degeneratie, cataract, glaucoom, retinoblastoom, en diabetische retinopathie zijn samengevat in transgene muizen. Een-vijf meeste transgene en knock-out muizen zijn van laboratoria die aan niet-oogheelkundige aandoeningen te bestuderen, maar genetische conservering tussen orgaansystemen suggereert dat veel van dezelfde genen kunnen ook een rol spelen bij ontwikkeling en oculaire ziekte. Vandaar dat deze muizen vormen een belangrijke bron voor het ontdekken van nieuwe genotype-fenotype correlaties in het oog. Omdat deze muizen zijn verspreid over de hele wereld, is moeilijk te verwerven, onderhouden en fenotype ze op een efficiënte en kosteneffectieve manier. Zo zijn de meeste high-throughput oogheelkundige fenotypering schermen beperkt tot enkele locaties die nodig on-site, oogheelkundige expertise om de ogen te onderzoeken in levende muizen. 6-9 Een alternatieve benadering die door ons laboratorium is een werkwijze voor remote weefsel acquisitie die gebruikt kunnen worden in kleine of grote schaal onderzoek van transgene muizen ogen. Gestandaardiseerde procedures voor video-gebaseerde chirurgische vaardigheden overdracht, weefsel fixatie, en de scheepvaart ervoor dat er geen lab op hele ogen te verzamelen van gemuteerde dieren en stuur ze voor de moleculaire en morfologische fenotypering. In deze video artikel zullen we technieken om ophelderen en zowel losgemaakte en perfusie vaste muis ogen dragen voor het op afstand fenotypering analyses.
Protocol
1. Stompe dissectie: Enucleatie van de muis oog in gefixeerde monsters
- Uit elkaar trekken van de oogleden om de blootstelling en de toegang tot de achterste wereld (oogbol) oppervlak te verbeteren.
- Plaats een gebogen dressing pincet achter (onder) de hele wereld in de baan (oogkas). De Mahajan Sharptip dressing pincet is een aangepaste instrument met spitse tips om deze stap te vergemakkelijken (zie materialen en reagentia tabel).
- Sluit de pincet en pak de orbitale bindweefsel en de oogzenuw achter de wereldbol terwijl ze voorzichtig om te voorkomen dat het knijpen in de hele wereld.
- Voorzichtig omhoog te trekken het pincet en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meeste transgene muizen bestaan in laboratoria die niet onderzoekt de ogen. Onze video-techniek illustreert een eenvoudige, gestandaardiseerde methode voor het op afstand chirurgische vaardigheid transfer naar weefsel overname optimaliseren van laboratoria met weinig ervaring met de ogen. Deze techniek helpt video overwinnen belangrijke valkuil in high-throughput fenotypering, die het gebruik van een beperkt aantal locaties deskundige door niet-gestandaardiseerde weefselverzameltoestel en bevestigingsmethoden die b.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Onderzoek naar blindheid te voorkomen; Bartly J. Mondino MD, directeur van het Jules Stein Eye Institute, UCLA, en Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui Wit, en Jeanne Estabel aan het Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus. Dit onderzoek voldoet aan de Arvo verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Visual Research.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Gebogen Dressing pincet | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing pincet | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Gebogen Westcott Schaar | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15 ° BD Beaver Microchirurgische Blade | Becton-Dickinson | 374881 | |
| 0,22 Fine-Castroviejo Hechten Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0,12 Colibri pincet | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge naald | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Visser | 03-523-4 | |
| Parafilm | Visser | 13-374-10 | |
| Glazen scintillatieflesjes | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7,4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2,5% paraformaldehyde / 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumfosfaatbuffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Gemengd in het laboratorium |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0,25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Politieagentper slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antilichaam | Abcam | Ab21974 | |
| Geit anti-konijn Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Het inbedden van hars Spurr's | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
Referenties
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
