Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

Samenvatting

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van zeer actieve Hsp104, een hexamere AAA + eiwit van gist, die koppels ATP hydrolyse aan eiwit desaggregatie. Deze regeling maakt gebruik van een His6-gelabeld bouwen voor affiniteitszuivering uit E. coli Gevolgd door anion-uitwisseling chromatografie, His6-tag verwijderen met TEV protease, en de grootte-uitsluiting chromatografie.

Samenvatting

Hsp104 is een hexamere AAA + eiwit ¹ van gist, die koppels ATP hydrolyse aan proteïne disaggregatie ^20-10 (afb. 1). Deze activiteit verleent twee belangrijke selectieve voordelen. De eerste, renaturatie van wanordelijke aggregaten door Hsp104 staat stelt gist overleving na diverse eiwit-misfolding benadrukt, met inbegrip van warmte shock ^3,5,11,12. Ten tweede, remodeling van de cross-beta-amyloïde fibrillen door Hsp104 maakt gist naar talloze prionen (besmettelijke amyloids) als een reservoir van nuttige exploiteren en fenotypische variatie erfelijk ^13-22. Opmerkelijk, Hsp104 renovaties direct preamyloid oligomeren en amyloid fibrillen, waaronder die welke deel uitmaken van de gist prioneiwitten Sup35 en Ure2 ^23-30. Dit amyloid-remodeling-functionaliteit is een gespecialiseerde facet van gist Hsp104. De E. coli ortholoog, ClpB, niet verbouwen preamyloid oligomeren of amyloid fibrillen ^26,31,32.

Hsp104 orthologen zijn te vinden in alle koninkrijken van het leven, behalve, perplexingly, dieren. Inderdaad, of dierlijke cellen een enzymatische systeem bezitten dat paren eiwit uitsplitsing naar renaturatie (in plaats van degradatie) blijft onbekend ^33-35. Zo hebben wij en anderen stelden dat Hsp104 zou kunnen worden ontwikkeld als een therapeutisch middel voor verschillende neurodegeneratieve ziekten die verband houden met de misfolding van specifieke eiwitten in giftige preamyloid oligomeren en amyloid fibrillen ^{4,7,23,36-38.} Er zijn geen behandelingen die direct gericht zijn op de geaggregeerde soorten geassocieerd met deze ziekten. Toch Hsp104 lost giftige oligomeren en amyloïd fibrillen samengesteld uit alfa-synucleïne, die verbonden zijn met de ziekte van Parkinson ²³ evenals amyloïd vormen van PrP ^39. Belangrijk is dat Hsp104 vermindert de aggregatie van eiwitten en verbetert neurodegeneratie in knaagdiermodellen van de ziekte van Parkinson ²³ en de ziekte van Huntington ^38. In het ideale geval de therapie te optimaliseren en het minimaliseren van bijwerkingen, zou Hsp104 worden ontworpen en versterkt om selectief verbouwen specifieke aggregaten centraal in de ziekte in kwestie ^4,7. Echter, de beperkte structurele en mechanistische begrip van hoe Hsp104 disaggregates zo'n divers repertoire van geaggregeerde structuren en ongerelateerde proteïnen frustreert deze inspanningen ^30,40-42.

Het begrijpen van de structuur en het mechanisme van Hsp104, is het essentieel om de pure proteïne en herstellen zijn disaggregase activiteit studie met een minimum aan componenten. Hsp104 is een 102kDa eiwit met een pi van ~ 5.3, die hexamerizes in aanwezigheid van ADP-of ATP, of bij hoge concentraties eiwitten in de afwezigheid van nucleotide ^43-46. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol voor de zuivering van zeer actieve, stabiele Hsp104 van E. coli. Het gebruik van E. coli maakt vereenvoudigde productie op grote schaal en onze methode kan snel en betrouwbaar worden uitgevoerd voor tal van Hsp104 varianten. Ons protocol verhoogt Hsp104 zuiverheid en vereenvoudigt Zijn _6-tag verwijderen vergelijking met een eerdere zuiveringsmethode van E. coli ^47. Bovendien is ons protocol is gemakkelijk en handig dan twee meer recente protocollen ^26,48.

Protocol

1. Expressie van Hsp104

1. Het plasmide gebruikt voor de zuivering in E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, bevat de Hsp104 open reading frame onder de induceerbare controle van de TRC promotor ^26. Het plasmide produceert Hsp104 met een N-terminale Zijn _6-tag die kan worden verwijderd door TEV protease splitsing. Transform pPROEX-HTB-Hsp104 in codon-geoptimaliseerde E. coli BL21-CodonPlus-RIL cellen (Stratagene, Agilent Technologies) met behulp van een typische bacteriële transformatie procedure (bijv. volgens de instructies van de fabrikant). Het is belangrijk dat het gebruik van een codon-geoptimaliseerde E. coli-s....

Discussie

Tijdlijn: Voor maximale Hsp104 activiteit raden wij aan dat de hele zuivering regeling zo snel worden afgerond mogelijk te maken. Echter, het aantal van zuivering stappen maakt een veeleisende schema dat niet altijd praktisch. Als de zuivering stappen worden uitgevoerd zo snel mogelijk, de tijd tussen het einde van de nacht uitdrukking tot en met de 2-4 uur incubatie bij 30 ° C met TEV protease is ongeveer 9-11 uur. Een mogelijke plek om te pauzeren is naar aanleiding van de TEV decollete stap. Indien absoluut no.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer
BL21-CodonPlus-RIL competente cellen	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT bouillon	USB	75864
Compleet, mini, EDTA-vrij proteaseremmer tabletten	Roche	1836170
Pepstatine A	Sigma	P4265
Ni-Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 centrifugaalfilter eenheden (MWCO 30.000)	Millipore	UFC903008
Resource Q - 6 ml kolom	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV Protease	Promega	V6052
AcTEV Protease	Invitrogen	12575015
Superose 6 10 / 300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Assay Designs	SPP-400
Hsp72	Assay Designs	ADI-NSP-555