Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

17.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/3190

⸱

30 september 2011

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van zeer actieve Hsp104, een hexamere AAA + eiwit van gist, die koppels ATP hydrolyse aan eiwit desaggregatie. Deze regeling maakt gebruik van een His6-gelabeld bouwen voor affiniteitszuivering uit E. coli Gevolgd door anion-uitwisseling chromatografie, His6-tag verwijderen met TEV protease, en de grootte-uitsluiting chromatografie.

Samenvatting

Hsp104 is een hexamere AAA + eiwit 1 van gist, die koppels ATP hydrolyse aan proteïne disaggregatie 20-10 (afb. 1). Deze activiteit verleent twee belangrijke selectieve voordelen. De eerste, renaturatie van wanordelijke aggregaten door Hsp104 staat stelt gist overleving na diverse eiwit-misfolding benadrukt, met inbegrip van warmte shock 3,5,11,12. Ten tweede, remodeling van de cross-beta-amyloïde fibrillen door Hsp104 maakt gist naar talloze prionen (besmettelijke amyloids) als een reservoir van nuttige exploiteren en fenotypische variatie erfelijk 13-22. Opmerkelijk, Hsp104 renovaties direct preamyloid oligomeren en amyloid fibrillen, waaronder die welke deel uitmaken van de gist prioneiwitten Sup35 en Ure2 23-30. Dit amyloid-remodeling-functionaliteit is een gespecialiseerde facet van gist Hsp104. De E. coli ortholoog, ClpB, niet verbouwen preamyloid oligomeren of amyloid fibrillen 26,31,32.

Hsp104 orthologen zijn te vinden in alle koninkrijken van het leven, behalve, perplexingly, dieren. Inderdaad, of dierlijke cellen een enzymatische systeem bezitten dat paren eiwit uitsplitsing naar renaturatie (in plaats van degradatie) blijft onbekend 33-35. Zo hebben wij en anderen stelden dat Hsp104 zou kunnen worden ontwikkeld als een therapeutisch middel voor verschillende neurodegeneratieve ziekten die verband houden met de misfolding van specifieke eiwitten in giftige preamyloid oligomeren en amyloid fibrillen 4,7,23,36-38. Er zijn geen behandelingen die direct gericht zijn op de geaggregeerde soorten geassocieerd met deze ziekten. Toch Hsp104 lost giftige oligomeren en amyloïd fibrillen samengesteld uit alfa-synucleïne, die verbonden zijn met de ziekte van Parkinson 23 evenals amyloïd vormen van PrP 39. Belangrijk is dat Hsp104 vermindert de aggregatie van eiwitten en verbetert neurodegeneratie in knaagdiermodellen van de ziekte van Parkinson 23 en de ziekte van Huntington 38. In het ideale geval de therapie te optimaliseren en het minimaliseren van bijwerkingen, zou Hsp104 worden ontworpen en versterkt om selectief verbouwen specifieke aggregaten centraal in de ziekte in kwestie 4,7. Echter, de beperkte structurele en mechanistische begrip van hoe Hsp104 disaggregates zo'n divers repertoire van geaggregeerde structuren en ongerelateerde proteïnen frustreert deze inspanningen 30,40-42.

Het begrijpen van de structuur en het mechanisme van Hsp104, is het essentieel om de pure proteïne en herstellen zijn disaggregase activiteit studie met een minimum aan componenten. Hsp104 is een 102kDa eiwit met een pi van ~ 5.3, die hexamerizes in aanwezigheid van ADP-of ATP, of bij hoge concentraties eiwitten in de afwezigheid van nucleotide 43-46. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol voor de zuivering van zeer actieve, stabiele Hsp104 van E. coli. Het gebruik van E. coli maakt vereenvoudigde productie op grote schaal en onze methode kan snel en betrouwbaar worden uitgevoerd voor tal van Hsp104 varianten. Ons protocol verhoogt Hsp104 zuiverheid en vereenvoudigt Zijn 6-tag verwijderen vergelijking met een eerdere zuiveringsmethode van E. coli 47. Bovendien is ons protocol is gemakkelijk en handig dan twee meer recente protocollen 26,48.

Protocol

1. Expressie van Hsp104

  1. Het plasmide gebruikt voor de zuivering in E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, bevat de Hsp104 open reading frame onder de induceerbare controle van de TRC promotor 26. Het plasmide produceert Hsp104 met een N-terminale Zijn 6-tag die kan worden verwijderd door TEV protease splitsing. Transform pPROEX-HTB-Hsp104 in codon-geoptimaliseerde E. coli BL21-CodonPlus-RIL cellen (Stratagene, Agilent Technologies) met behulp van een typische bacteriële transformatie procedure (bijv. volgens de instructies van de fabrikant). Het is belangrijk dat het gebruik van een codon-geoptimaliseerde E. coli-stam omdat Hsp104 heeft een ongewone codon bias.
  2. Inoculeren een 100 ml 2XYT cultuur (USB. Recept: 16g / L caseïne pepton, 10g / L gistextract, 5 g / L NaCl, pH 7,0) aangevuld met 100μg/mL ampicilline en 34μg/mL chlooramfenicol met verse transformanten en groeien 's nachts bij 37 ° C onder schudden bij max. 200 omw.
  3. Inoculeren 10 ml van de overnacht cultuur in 6 X 1L 2XYT met 100μg/mL ampicilline en 34μg/mL chlooramfenicol in 2L kolven. Schudden op 250rpm bij 37 ° C tot OD 600 = 0.4 tot 0,6. Stop schudden en de temperatuur tot 15 ° C. te verlagen Laat cellen in evenwicht unagitated voor 30min in de couveuse tot aan 15 ° C. Zodra 15 ° C wordt bereikt induceren eiwit-expressie door het toevoegen van IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Hervatten schudden bij 250rpm 's nachts (12-16 uur).

2. Cel Oogst en Lysis

  1. Oogst cellen door centrifugeren (in een voorgekoeld rotor) bij 4.000 tpm voor 20min bij 4 ° C (we gebruiken een Sorvall RC 3BP + centrifuge). Volgende stappen moeten onmiddellijk worden uitgevoerd omdat Hsp104 activiteit is verminderd wanneer E. coli-cellen zijn bevroren. Bovendien moet alle volgende stappen worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C.
  2. Resuspendeer celpellets in prechilled (op ijs) 10 ml lysis buffer (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 500mm KCl, 20mm MgCl 2, 2,5% (w / v) glycerol, 20mm imidazol, 5 urn pepstatine A, compleet proteaseremmer cocktail (een EDTA -vrij tablet/50mL), en 2 mm β-mercapto-ethanol).
  3. Lyse cellen met een Franse pers (Emulsiflex) homogenisator dat een warmtewisselaar ondergedompeld in ijswater gebruikt. Voor het gebruik, ervoor zorgen dat alle cel klonten zijn opgelost. Na equilibreren homogenisator met lysis buffer, twee gaat door de cilinder met een druk van 15,000-18,000 psi voldoende is voor een volledige lysis. Als een Franse pers is niet beschikbaar is, kan incubatie met lysozyme, gevolgd door sonicatie worden gebruikt (zie discussie). Sla een kleine steekproef van gelyseerde cellen voor SDS-PAGE analyse (1μL) (Lysate in Fig. 2).
  4. Verwijder celresten door centrifugatie bij 16.000 rpm voor 20min bij 4 ° C (we gebruiken een Sorvall RC5C + centifuge). Behouden supernatant voor de volgende stap en opslaan van een kleine steekproef (1μL) van supernatant voor SDS-PAGE-analyse (Ni Load in Fig. 2).

3. Hsp104 Zuivering

  1. Mix supernatans van stap 2.4 met 12ml (2 ml Ni-Sepharose kralen per 1 l van cellen) van 50% suspensie van lysis buffer in evenwicht gebracht Ni-Sepharose kralen (GE).
  2. Langzaam draaien monster gedurende 3 uur bij 4 ° C, zodat Ni-Sepharose blijft gelijkmatig geschorst en schuimvorming wordt geminimaliseerd. Kortere incubatietijden zijn mogelijk, maar zal afnemen opbrengst. Bij 4 ° C in de aanwezigheid van protease-inhibitoren, weinig degradatie optreedt, en een 3 uur Ni-Sepharose incubatietijd neemt niet af activiteit van het eindproduct. Verzamel Ni-Sepharose door centrifugatie gedurende 2 minuten bij 4 ° C bij 2.000 tpm (Eppendorf centrifuge 5810R). Sla een kleine steekproef van supernatant voor SDS-PAGE analyse (1μL) en gooi de rest (Ni doorstroming (FT) in Fig. 2).
  3. Was de opgehaalde Ni-Sepharose met 25 kolomvolumes wasbuffer (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20mm MgCl 2, 2,5% (w / v) glycerol, 20mm imidazol, 2mm β-mercapto-ethanol), 5 kolomvolumes wasbuffer met 1M KCl om verontreinigingen elektrostatisch gebonden aan Hsp104, en 25 kolomvolumes wasbuffer te verwijderen. Verzamel Ni-Sepharose na iedere wasbeurt door centrifugatie gedurende 2 minuten bij 4 ° C bij 2.000 tpm (Eppendorf centrifuge 5810R). Na elke wassen en centrifugeren cyclus, verwijder buffer door aspiratie.
  4. Om Hsp104, mix Ni-Sepharose elueren met 1 ml elutiebuffer (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20mm MgCl 2, 2,5% (w / v) glycerol, 350mm imidazol, 2mm β-mercapto-ethanol) per 1 ml Ni-Sepharose en draaien bij 4 ° C gedurende 20 minuten. De hoge imidazol concentratie verstoort de Ni-kraal Zijn zes interactie. Verwijder de Ni-Sepharose met een lege 1,2 ml spin-kolommen (Bio-Rad) door middel van centrifugeren gedurende 2 min bij 4 ° C bij 2.000 tpm (Eppendorf centrifuge 5810R). Bespaar 1μL eluaat voor SDS-PAGE-analyse (Ni eluaat op in Fig. 2). Voor elke liter van cellen, is ~ 15 mg van Hsp104 verkregen bij deze stap.
  5. Buffer uitwisseling eluaat in Buffer Q (20mm Tris-HCl pH 8, 0,5 mm EDTA, 5mM MgCl2, 50 mM NaCl) met behulp van MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) 15ml centrifugale concentrator eenheden. Eerst, eiwit dan concentreren op ~ 1,5 ml toe te voegen 14.5mL van Buffer Q tot eiwit verdunnen 10-voudig. Herhaal dit 3 keer voor-buffer uit te wisselen. De stijging van de pH en een laag zout zorgt ervoor dat Hsp104 een hoge negatieve lading heeft.
  6. Zuiver Hsp104 via anion-uitwisseling chromatografie met behulp van een Buffer Q evenwicht Resource Q 6ML kolom (GE). Vóór injectie, wordt eiwit gefilterd door een lage eiwitbinding Millex GP PES Membrane 0.22μM spuit filter (Millipore). Wij werken met een debiet van 1mL/min. Afwassen zwak bindende eiwitten met 1 kolom volume van 20% Buffer Q + (20mm Tris-HCl pH 8, 0,5 mm EDTA, 5mM MgCl 2, 1 M NaCl). Elueer Hsp104 met een lineaire gradiënt (20% -50% Buffer Q +) over 5 kolomvolumes (afb. 3). Verzamel 1 ml fracties. Hsp104 en de meeste varianten typisch elueren bij ~ 400mm NaCl (31mS/cm). Bespaar monsters van piek fracties (1μL) voor SDS-PAGE analyse (Fig. 3, inzet).
  7. Zijn 6-tag te verwijderen, uitwisseling eiwit met behulp van de Amicon centrifugale concentrator zoals hierboven beschreven (zie stap 3.5) in decollete buffer (20mm HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, en 10mm MgCl 2). Gebruik proTEV protease (Promega) of AcTEV protease (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Voor Hsp104, hebben we ontdekt dat een hogere ratio's van de TEV protease: Hsp104 zijn vereist voor volledige decollete. We maken gebruik van een ratio van 1 protease eenheid per 12μg Hsp104. Splitsing moet worden uitgevoerd bij 30 ° C gedurende 2-4 uur, gevolgd door een 16 uur incubatie bij 4 ° C. Uiteindelijke Hsp104 concentratie moet tussen de 20-75μM monomeer. Afbrekende eventuele resterende His6-gelabeld Hsp104 en TEV protease met Ni-Sepharose (GE) door de toevoeging van Ni-Sepharose dan tot het bedrag van Hsp104 in de splitsing reactie (veronderstellen kralen kunnen binden 15 mg eiwit per ml verpakt hars). Verwijder de kralen met lege spin-kolommen (Bio-Rad) door het centrifugeren voor 2min bij 2.000 tpm bij 4 ° C. Te verzamelen monsters voor en na de splitsing (1μL) voor SDS-PAGE analyse splitsing, en de verwijdering van niet-geknipte eiwit (afb. 4) te verzekeren.
  8. Exchange naar grootteklasse uitsluiting buffer (20mm HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mm EDTA, 1 mM DTT) met behulp van MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) zoals beschreven in stap 3.5.
  9. Verder te zuiveren Hsp104 via size-exclusion chromatografie. Gebruik grootte uitsluiting buffer in evenwicht gebracht Superose 6 of Superdex 200 kolom (zowel van GE) (fig. 5). Vóór injectie, wordt eiwit gefilterd door een lage eiwitbinding Millex GP PES Membrane 0.22μM spuit filter (Millipore). Voor minder dan 10 mg eiwit, kan de grootte van 10/300 kolommen (24ml) worden gebruikt en 0,5 ml fracties worden verzameld. Voor monsters groter is dan 10 mg, moet de grootte van 12/60 kolom (120 ml) worden gebruikt en 1 ml fracties worden verzameld. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor flow-rate en sample volumes worden geladen. Na zuivering wordt Hsp104 fracties samengevoegd zoals getoond in Fig. 5 en geconcentreerd in Amicon Centrifugaal Concentrator Units (Millipore). Hsp104 wordt opgeslagen zoals hieronder beschreven. Te wijten aan het verlies van materiaal in het scheiden van Hsp104 afbraakproducten en verontreinigingen van de uiteindelijke opbrengst van gezuiverd full-length Hsp104 is ~ 1-3 mg per liter van het starten van cultuur.

4. Hsp104 Disaggregase Activiteit

  1. Na zuivering, is het een goede gewoonte om Hsp104 activiteit in een desaggregatie test te beoordelen. Normaal gesproken maken we gebruik van een luciferase reactivering analyse 2 (Fig. 6). In deze test, Hsp104 in combinatie met het Hsp70 chaperonne-systeem (Hsp70 en Hsp40) disaggregates ureum-gedenatureerde vuurvlieg luciferase aggregaten 2. Oplosbare luciferase katalyseert de oxidatie van luciferine om oxyluciferine, een reactie die licht releases. Door het monitoren van luminescentie, de relatieve reactivering, en daarom disaggregatie, kan van luciferase worden bepaald. Hsp104 moet kunnen synergetisch samenwerken met de Hsp70 co-chaperonne-systeem. De hoeveelheid nuttig toegepast luminescentie is afhankelijk van de exacte Hsp70: Hsp40 paar benut. We routinematig werk Hsp72 en Hsp40 (Assay Designs). Op zijn minst moet actief Hsp104 produceren een 5-voudige toename van de reactivering van de luciferase in vergelijking met de reactivering van Hsp72: Hsp40 alleen (Fig. 6). Hsp104 bereidingen die niet aan dit niveau van activiteit te bereiken worden verwijderd.

5. Hsp104 Opslag

  1. Voor de korte termijn opslag kan Hsp104 worden bewaard bij 4 ° C in grootte-uitsluiting buffer. Toch zal de activiteit dalen na 2-3 dagen bij 4 ° C en scherp na 1 week bij 4 ° C. Voor de uitsplitsing assays adviseren wij Hsp104 moeten zo snel mogelijk worden gebruikt na zuivering. Idealiter zou Hsp104 direct worden gebruikt voor amyloïd disaggregatie assays.
  2. Als eiwit moet worden opgeslagen op lange termijn, is Hsp104 uitgewisseld in opslag buffer (20mm HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mm EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol (w / v)). 100μl aliquots zijn snap ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C. Vries-dooi cycli drastisch te verminderen Hsp104 activiteiten moet worden vermeden. Wij raden langzaam ontdooien Hsp104 op ijs. Amyloid-disaggregase activiteit zal fors afnemen na 1 maand bij -80 ° C.

6. Representatieve resultaten en cijfers:

Figuur 1
Figuur 1. Hsp104 is een bifunctionele disaggregase. Uitsplitsing van ongeordende aggregaten (zie links) vereist de medewerking van de Hsp70 chaperonne-systeem (Hsp70 en Hsp40) 2. Hsp104 renovaties amyloid aggregaten (zie rechts) bestelde zonder de hulp van Hsp70 en Hsp40 in vitro, maar Hsp70 en Hsp40 kunnen Hsp104 activiteiten aan te moedigen tegen amyloïde 26,28. Voor beide typen van geaggregeerde structuren, Hsp104 koppels ATP hydrolyse tot substraat translocatie door zijn centrale kanaal naar desaggregatie te bevorderen. Tyrosine-dragende porie loops te betrekken en shuttle substraat door het centrale kanaal 49-52.

Figuur 2
Figuur 2. SDS-PAGE analyse van de Ni-Sepharose affiniteitszuivering stap. Lysate, Ni Load, Ni FT en Ni eluaat monsters werden gefractioneerd door SDS-PAGE met behulp van een 4-20% Tris-HCl 1,0 mm Criterion gel (Bio-Rad) en Coomassie gekleurd . Merk op dat niet alle Hsp104 in staat is te binden aan de Ni-sefarose. BroadRange molecuulgewichtmerkers (Bio-Rad) worden weergegeven (links voorsorteren).

Figuur 3
Figuur 3. Resource Q zuivering van Ni-sepharose eluaat. Blauwe trace vertegenwoordigt absorptie bij 280nm en groen trace vertegenwoordigt% Buffer Q + (maximum bij 50%). De eerste piek, die elueert op 20% Q + bevat onzuiverheden, afbraakproducten en onjuist gevouwen Hsp104. De tweede en belangrijkste piek bevat correct gevouwen en actieve Hsp104. Debiet was 1ml/min. Gradiënt van 20-50% Q + is 30 minuten of 5 kolom volumes. Inzet: piek breuken worden opgelost door middel van SDS-PAGE analyse met behulp van een 4-20% Tris-HCl 1,0 mm Criterion gel (Bio-Rad) en Coomassie gekleurd. BroadRange molecuulgewichtmerkers (Bio-Rad) worden weergegeven (links).

Figuur 4
Figuur 4. SDS-PAGE-analyse van proTEV protease decollete stap. Zijn 6-Hsp104 van Resource Q zuivering werd behandeld met proTEV protease gedurende 4 uur bij 30 ° C en vervolgens 16 uur bij 4 ° C. Monsters werden de gefractioneerd door SDS-PAGE met behulp van een 4-20% Tris-HCl 1,0 mm Criterion gel (Bio-Rad) en Coomassie gekleurd. Merk op dat proTEV gesplitst Hsp104 migreert sneller. TEV protease en ongekliefd Hsp104 zijn uitgeput met Ni-Sepharose zoals beschreven in stap 3.7. BroadRange molecuulgewichtmerkers (Bio-Rad) worden weergegeven (links).

Figuur 5
Figuur 5. Grootte-uitsluiting zuivering van Hsp104. Gekliefde Hsp104 werd verder gezuiverd via een Superose 6 gelfiltratie kolom (10/300, GE). Debiet = 0.4ml/min. De piek tussen de gestippelde lijnen vertegenwoordigt samengevoegde fracties. Inzet: piek breuken worden opgelost door middel van SDS-PAGE analyse met behulp van een 4-20% Tris-HCl 1,0 mm Criterion gel (Bio-Rad) en Coomassie gekleurd. BroadRange molecuulgewichtmerkers (Bio-Rad) worden weergegeven (links).

Figuur 6
Figuur 6. Luciferase assay reactivering. Gedenatureerde vuurvliegluciferase aggregaten (50nm) werden geïncubeerd met ofwel Hsp72 en Hsp40 (1 uM) (beide uit Assay Designs), Hsp104 (6μM monomeer) of Hsp104, Hsp72 en Hsp40 voor 90min bij 25 ° C. Gedenatureerd luciferase is alleen volledig geactiveerd in de aanwezigheid van zowel Hsp104 en Hsp40/Hsp72. Hersteld luminescentie wordt gemeten op een Infinite M1000 plaatlezer (Tecan). Waarden vertegenwoordigen gemiddelden ± SEM (n = 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tijdlijn: Voor maximale Hsp104 activiteit raden wij aan dat de hele zuivering regeling zo snel worden afgerond mogelijk te maken. Echter, het aantal van zuivering stappen maakt een veeleisende schema dat niet altijd praktisch. Als de zuivering stappen worden uitgevoerd zo snel mogelijk, de tijd tussen het einde van de nacht uitdrukking tot en met de 2-4 uur incubatie bij 30 ° C met TEV protease is ongeveer 9-11 uur. Een mogelijke plek om te pauzeren is naar aanleiding van de TEV decollete stap. Indien absoluut no...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de NIH (5T32GM008275-22) en een American Heart Association predoctorale gemeenschap (naar EAS), een scheikunde-biologie Interface Fellowship van de NIH (2T32GM071339-06A1) (tot MED), en subsidies van de NIH (1DP2OD002177-01 en NS067354-0110), De Ellison Medical Foundation en de Bill and Melinda Gates Foundation (naar JS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogus nummer
BL21-CodonPlus-RIL competente cellen Stratagene, Agilent Technologies 230255
2XYT bouillon USB 75864
Compleet, mini, EDTA-vrij proteaseremmer tabletten Roche 1836170
Pepstatine A Sigma P4265
Ni-Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-5318-02
Amicon Ultra-15 centrifugaalfilter eenheden (MWCO 30.000) Millipore UFC903008
Resource Q - 6 ml kolom GE Healthcare 17-1179-01
proTEV Protease Promega V6052
AcTEV Protease Invitrogen 12575015
Superose 6 10 / 300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Hsp40 Assay Designs SPP-400
Hsp72 Assay Designs ADI-NSP-555

Referenties

  1. Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
  2. Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System that Rescues Previously Aggregated Proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
  3. Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
  4. Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88, 1-13 (2010).
  5. Parsell, D. A., Sanchez, Y., Stitzel, J. D., Lindquist, S. Hsp104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites. Nature. 353, 270-273 (1991).
  6. Doyle, S. M., Wickner, S. Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines. Trends Biochem Sci. 34, 40-48 (2009).
  7. Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16, 63-74 (2008).
  8. Glover, J. R., Lum, R. Remodeling of protein aggregates by Hsp104. Protein Pept Lett. 16, 587-597 (2009).
  9. Mogk, A., Haslberger, T., Tessarz, P., Bukau, B. Common and specific mechanisms of AAA+ proteins involved in protein quality control. Biochem Soc Trans. 36, 120-125 (2008).
  10. Grimminger-Marquardt, V., Lashuel, H. A. Structure and function of the molecular chaperone Hsp104 from yeast. Biopolymers. 93, 252-276 (2010).
  11. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248, 1112-1115 (1990).
  12. Sanchez, Y., Taulien, J., Borkovich, K. A., Lindquist, S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress. Embo J. 11, 2357-2364 (1992).
  13. Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137, 146-158 (2009).
  14. Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20, 125-1233 (2010).
  15. Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6, 435-450 (2005).
  16. True, H. L., Berlin, I., Lindquist, S. L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature. 431, 184-187 (2004).
  17. True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407, 477-483 (2000).
  18. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, e294-e294 (2008).
  19. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268, 880-884 (1995).
  20. Halfmann, R., Lindquist, S. Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits. Science. 330, 629-632 (2010).
  21. Satpute-Krishnan, P., Langseth, S. X., Serio, T. R. Hsp104-dependent remodeling of prion complexes mediates protein-only inheritance. PLoS Biol. 5, e24-e24 (2007).
  22. Sweeny, E. A., Shorter, J. Prion proteostasis: Hsp104 meets its supporting cast. Prion. 2, 135-140 (2008).
  23. Lo Bianco, C. Hsp104 antagonizes alpha-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 118, 3087-3097 (2008).
  24. Narayanan, S., Walter, S., Reif, B. Yeast prion-protein, sup35, fibril formation proceeds by addition and substraction of oligomers. Chembiochem. 7, 757-765 (2006).
  25. Savistchenko, J., Krzewska, J., Fay, N., Melki, R. Molecular chaperones and the assembly of the prion Ure2p in vitro. J Biol Chem. 283, 15732-15739 (2008).
  26. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304, 1793-1797 (2004).
  27. Shorter, J., Lindquist, S. Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hsp104 remodeling activities. Mol Cell. 23, 425-438 (2006).
  28. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70 and Hsp40 interplay regulates formation, growth and elimination of Sup35 prions. Embo J. 27, 2712-2724 (2008).
  29. Doyle, S. M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity. Nat Struct Mol Biol. 14, 114-122 (2007).
  30. Wendler, P. Atypical AAA+ subunit packing creates an expanded cavity for disaggregation by the protein-remodeling factor Hsp104. Cell. 131, 1366-1377 (2007).
  31. Hinault, M. P. Stable alpha-synuclein oligomers strongly inhibit chaperone activity of the Hsp70 system by weak interactions with J-domain co-chaperones. J Biol Chem. 285, 38173-38182 (2010).
  32. Tipton, K. A., Verges, K. J., Weissman, J. S. In vivo monitoring of the prion replication cycle reveals a critical role for Sis1 in delivering substrates to Hsp104. Mol Cell. 32, 584-591 (2008).
  33. Bieschke, J., Cohen, E., Murray, A., Dillin, A., Kelly, J. W. A kinetic assessment of the C. elegans amyloid disaggregation activity enables uncoupling of disassembly and proteolysis. Protein Sci1. 8, 2231-2241 (2009).
  34. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313, 1604-1610 (2006).
  35. Cohen, E. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
  36. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 23, 1191-11201 (2010).
  37. Carmichael, J. Bacterial and yeast chaperones reduce both aggregate formation and cell death in mammalian cell models of Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci. 97, 9701-9705 (2000).
  38. Vacher, C., Garcia-Oroz, L., Rubinsztein, D. C. Overexpression of yeast hsp104 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington's disease. Hum Mol Genet. 14, 3425-3433 (2005).
  39. Liu, Y. H. Heat Shock Protein 104 Inhibited the Fibrillization of Prion Peptide 106-126 and Disassembled Prion peptide 106-126 Fibrils in vitro. Int J Biochem Cell Biol. , (2011).
  40. Wendler, P., Saibil, H. R. Cryo electron microscopy structures of Hsp100 proteins: crowbars in or out. Biochem Cell Biol. 88, 89-96 (2010).
  41. Wendler, P. Motor mechanism for protein threading through Hsp104. Mol Cell. 34, 81-92 (2009).
  42. Lee, S., Sielaff, B., Lee, J., Tsai, F. T. CryoEM structure of Hsp104 and its mechanistic implication for protein disaggregation. Proc Natl Acad Sci. 107, 8135-8140 (2010).
  43. Parsell, D. A., Kowal, A. S., Lindquist, S. Saccharomyces cerevisiae Hsp104 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes. J Biol Chem. 269, 4480-4487 (1994).
  44. Schirmer, E. C., Queitsch, C., Kowal, A. S., Parsell, D. A., Lindquist, S. The ATPase activity of Hsp104, effects of environmental conditions and mutations. J Biol Chem. 273, 15546-15552 (1998).
  45. Schirmer, E. C., Ware, D. M., Queitsch, C., Kowal, A. S., Lindquist, S. L. Subunit interactions influence the biochemical and biological properties of Hsp104. Proc Natl Acad Sci. 98, 914-919 (2001).
  46. Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Cooperative kinetics of both Hsp104 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J. 21, 12-21 (2002).
  47. Schirmer, E. C., Lindquist, S. Purification and properties of Hsp104 from yeast. Methods Enzymol. 290, 430-444 (1998).
  48. Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hsp104 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc Natl Acad Sci. 99, 2732-2737 (2002).
  49. Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J Biol Chem. 283, 30139-30150 (2008).
  50. Lum, R., Tkach, J. M., Vierling, E., Glover, J. R. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hsp104. J Biol Chem. 279, 29139-29146 (2004).
  51. Tessarz, P., Mogk, A., Bukau, B. Substrate threading through the central pore of the Hsp104 chaperone as a common mechanism for protein disaggregation and prion propagation. Mol Microbiol. 68, 87-97 (2008).
  52. Weibezahn, J. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell. 119, 653-665 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hsp104-zuiveringhistidine-affiniteitslabelionenuitwisselingschromatografiegelfiltratieluciferase-reactivatie-assayTEV-protease-splitsingE. coli-expressieanionenuitwisseling大きte-uitsluiting
Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.