Beschrijven we een In vitro Methode voor het kweken van schistosomula van de platworm parasiet Schistosoma mansoni, Via het oogsten en de transformatie van infectieuze cercariae van het zoete water slak tussengastheer Biomphalaria glabrata.
Methodenartikel
Cercarial Transformatie en In vitro Teelt van Schistosoma mansoni Schistosomules
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Schistosoma parasieten zijn de verwekkers van schistosomiasis, een chronisch invaliderende ziekte die meer dan 200 miljoen mensen lijden wereldwijd en op de tweede plaats om malaria onder de parasitaire ziekten op het gebied van de volksgezondheid en de sociaal-economische gevolgen (1-4). Schistosome parasieten zijn trematode wormen met een ingewikkelde levenscyclus verwisselen tussen een parasitaire leven in weekdieren en zoogdieren gastheren met tussenliggende vrij zwemmende stadia. In het kort, vrij zwemmende cercariae infecteren van een zoogdier gastheer door het penetreren van de huid met behulp van afgescheiden proteasen, gedurende welke tijd de cercariae hun staart verliezen, verandert in schistosomules. De schistosomules moet nu ontwijken de gastheer immuunsysteem, het ontwikkelen van een darm voor de vertering van rode bloedcellen, en migreren hoewel de longen en de portale circulatie op weg naar hun eindbestemming in de lever portal systeem en uiteindelijk de mesenteriale aderen (voor S. mansoni) waar de mannelijke en vrouwelijke wormen paren en paren, het produceren van honderden eitjes per dag. Een deel van de eieren worden uitgescheiden uit het lichaam in zoet water, waar de eieren uitkomen in het vrije-zwemmen miracidia (5-10). De miracidia infecteren specifieke slakkensoorten en te transformeren tot moeder en dochter sporocysts, die op hun beurt, produceren infectieuze cercariae, het voltooien van de levenscyclus. Helaas kan de hele schistosome levenscyclus niet worden gekweekt in vitro, maar infectieuze cercariae kunnen worden omgezet in schistosomules, en de schistosomules kunnen worden gekweekt voor de week voor de analyse van schistosome ontwikkeling van in vitro of microarray analyse. In dit protocol, bieden wij een visuele beschrijving van cercarial transformatie en in vitro kweken van schistosomules. We werpen besmettelijk cercariae van de slak gastheer Biomphalaria glabrata en ze handmatig omzetten in schistosomules door het losmaken van hun staart met behulp van een emulgerende overloopnaald. De in vitro cercarial transformatie en schistosomules cultuur technieken beschreven vermijden het gebruik van een zoogdier gastheer, die visualisatie van schistosomen vereenvoudigt en vergemakkelijkt de verzameling van de parasiet voor experimentele analyse. Transformatie en in vitro kweken technieken van schistosomen zijn gedaan voor de jaren (11, 12), maar geen visuele protocollen ontwikkeld die beschikbaar zijn voor de gehele gemeenschap.
Protocol
Veiligheidsmaatregelen:
Schistosome cercariae kan direct doordringen in de huid zonder de behoeften van een gesneden of poriën, en de oorzaak van de chronische ziekte schistosomiasis. S. mansoni is een bioveiligheidsniveau twee organisme, dus de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en de juiste veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het werken met infectieuze cercaria. Het merendeel van de apparatuur die nodig is om te groeien en te transformeren schistosomen is standaard, met een paar belangrijke uitzonderingen vermeld in de tabel aan het einde van het protocol. Alle cercarial werk moet worden gedaan in een geïsoleerde kamer. Schistosomules moet worden gekweekt in een steriele, goedgekeurd bioveiligheid kap. Twee lagen nitril of latex handschoenen worden gedragen, evenals een laboratoriumjas, een waterdichte paar schoenen, broek met geen gaten of scheuren, en waterdicht mouwbeschermers voor uw polsen en armen. In het geval van een ongeluk morsen, onmiddellijk spuiten verontreinigde plek met 70% ethanol of 10% bleekmiddel, wrijven krachtig als op uw persoon. Dit zal voldoende zijn om de parasiet uit te schakelen, maar alle mogelijke infecties moeten worden gemeld en serieus genomen. Hoewel schistosomules zijn niet aangeboren besmettelijk, institutionele richtlijnen variëren, en dient te worden geraadpleegd om te bepalen of BSL2 voorzorgsmaatregelen nodig zijn tijdens de niet-infectieuze levensfasen. Desinfecteer alle oppervlakken die in contact komen met potentieel besmettelijke stof na het experiment wordt uitgevoerd en gooi afval in een goedgekeurd biohazard container.
LET OP: Cover slak gastheer bakken 1 tot 2 dagen voorafgaand aan de uitscheiding en bescherming tegen licht
1. Oogsten cercariae van de slak gastheer
- Vul een schone, 500ml beker vrij van detergenten de helft vol met gedestilleerd water op kamertemperatuur. Als het werken met host slakken geïnfecteerd met miracidia op verschillende data, gebruik dan een aparte beker voor elke infectie datum (Dit is vooral van belang als de slakken zal worden hergebruikt voor toekomstige experimenten). De grootte van de beker kan ook kleiner zijn, afhankelijk van de ervaring van de gebruiker.
- Verzamel geïnfecteerde slak hosts die u wilt werpen en zorgvuldig deponeren ze in de beker met behulp van een standaard aquarium vissen net en voor algemene doeleinden tang als nodig is.
- Plaats bekerglas op een spill ongeveer 8 tot 12 centimeter lade onder een gloeilamp. Laat staan voor 1-2 uur onder het licht. Cercariae verlaten de slak gastheer wanneer ze worden blootgesteld aan fel licht.
- Zorgvuldig te filteren slakken uit de cercariae mengsel. Neem extra voorzorgsmaatregelen, als mengsel is zeer besmettelijk. Onthoud cercariae direct kan de menselijke huid binnen te dringen!
- Vervang mengsel onder lichtbron gedurende ongeveer 15 minuten, waardoor alle deeltjes afvalstoffen om zich te vestigen.
- Transfer cercariae in een schone erlenmeyer met behulp van een pipet, het vermijden van het puin op de bodem van de beker. Plaats de kolf op ongeveer een hoek van 45 ° op het ijs in het donker voor 45 - 60 minuten, waardoor cercariae zich te vestigen in een hoek.
- Gebruik een 50 ml pipet tot 75 tot 90% van het supernatant te verwijderen en deze deponeren in bekerglas met 10% bleekmiddel of 70% ethanol, waarbij zorg niet te laten waterdruppels bevat cercariae druppelen uit de pipet.
- Schud de erlenmeyer met cercariae zachtjes aan de cercariae in oplossing mengen. Gebruik een pipet om het monster over te dragen aan steriele 50 ml conische buizen. Weer plaats buizen op ijs gedurende 20 minuten in het donker. Cercariae zal regelen naar de onderkant van de buis in het donker.
2. Handmatige transformatie van cercariae aan schistosomules
Voordat u begint: Zorg RPMI 1640 compleet (RPMI, 5% Fetal Bovine Serum, 1X Pen / Strep) en warm tot 37 ° C. (Het is cruciaal dat de foetale gebruikte bovine serum werd geïnactiveerd door incubatie een 56 ° C gedurende 1 uur als schistosomen kunnen gevoelig zijn aan te vullen).
- In een biohazard kap, verwijder supernatant tot 5 tot 10 ml van de oplossing in elk 50 ml conische met behulp van een pipet of vacuüm apparaat.
- Bevestig een 22 gauge double-ended, Luer Lok emulgeren naald om een juiste maat spuit.
- Langzaam trekken mengsel in de spuit. Verzamel cercariae van alle 50 ml buizen in een spuit. Wees attent van druipen.
- Draai spuit over zulke dat de losse naald einde is omhoog. Bevestig de andere spuit om deze kant van het emulgeren naald.
- Passeren het mengsel door de naald in totaal 40 keer (20 keer heen en weer) naar de cercariae transformeren.
- Plaats de spuiten verticaal zodanig dat het mengsel is opgenomen in de bodem spuit en de bovenkant spuit leeg is. Verwijder de top spuit en desinfecteren in 70% ethanol.
- Borgsom mengsel druppelsgewijs in een schone hoog ommuurde 100mm x 50mm pyrex schotel of kristalliserende schotel. Desinfecteer naald en spuit in 70% ethanol.
- Voeg 37 ° C RPMI 1640 complete media zodanig dat debodem van de petrischaal is volledig bedekt, als het gieten een Luria bouillon plaat.
- Roer voorzichtig om schistosomules verzamelen in het midden van de petrischaal. Vermijd spatten.
Opmerking: Het kan nuttig zijn uit te schakelen de motorkap licht voor deze stap om meer adequaat te visualiseren de schistosomules in het centrum. - Onmiddellijk storten geconcentreerd schistosomules in een frisse 12-well celkweek plaat goed af met een steriele pipet.
- Herhalen 2.9 en 2.10 tot schistosomules niet meer aanwezig zijn in het centrum van de schotel (ongeveer 10 keer). Storting elk vervolgens wordt opgevangen in een frisse goed.
- Vul elk putje tot halverwege (~ 1,5 ml) met een voorverwarmde RPMI complete media.
- Visualiseren op een omgekeerde microscoop op de aanwezigheid van schistosomules en afwezigheid van cercariae te verifiëren.
- Groeien de schistosomules in een CO 2 incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2.
3. Representatieve resultaten:
In afwachting van de overdracht van getransformeerde schistosomules in cultuur media, visualisatie onder een omgekeerde bright-veld microscoop (zie tabel apparatuur voor een voorbeeld) moet opleveren een afbeelding lijkt op een, waarin alleen getransformeerd schistosomules aanwezig zijn in de goed figuur. Potentiële contaminanten kunnen zijn intact cercariae, doorgesneden cercarial staarten, of ander afval. Als er geen omgekeerde microscoop beschikbaar is, wordt een standaard microscoop of zelfs een dissectie ruimte zijn voldoende om de schistosomules visualiseren. Merk op dat deze procedure niet altijd 100% van de cercariae transformeren.
Figuur 1: Transformed Schistosomulum
Figuur 2: cercariae en Severed Tails
Discussie
Een aantal mogelijke problemen kunnen ontstaan tijdens de transformatie procedure, maar dit protocol is ontworpen om de meeste van deze problemen te voorkomen. Een potentieel gevaar is de verstopping van de naald emulgeren, die meestal ontstaat door puin dat overbleef van de oogst in stap 1.3. Zorg ervoor om alle deeltjes om zich te vestigen in stap 1.5 en de cercariae zorgvuldig overdracht in stap 1.6 om dit probleem te voorkomen. Ook, zoals eerder beschreven, het werken in een biologisch veiligheidskabinet, gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (zelfs gelaatsschermen) en het vermijden van overmatige druk op het spuiten is aan te raden.
Vrijstaande cercarial staarten kunnen worden gevisualiseerd in de media, die wijzen op een slechte scheiding is bij stap 2.9. De staarten vertonen een spasme-achtige beweging en hebben een aparte vorm (zie figuur 2), wat zich dus gemakkelijk te onderscheiden van de schistosomules. De staarten kunnen worden verwijderd door het wassen van de schistosomules dan RPMI te voltooien zodat de schistosomules om zich te vestigen. De staarten blijft drijven en kan worden gestofzuigd uit.
Als intact cercariae aanwezig zijn in de media, was de transformatie in stap 2.5 niet goed uitgevoerd. Een beeld van een intacte cercaria is afgebeeld in figuur 3b ter referentie. Als dit probleem zich voordoet, zorgen dat het emulgeren naald wordt gebruikt is van de juiste grootte. Ook kan het aantal keren dat de cercarial mengsel wordt doorgegeven via de naald worden verhoogd, ook al 40 keer is meestal veel meer dan genoeg om 100% afschuiven van de cercarial staarten aanpak.
Transformatie van cercaria in schistosomules werd voor het eerst beschreven in 1974 door Colley en Wikel (13). Sindsdien is de voorbereiding van schistosomules is gedaan met behulp van de afschuiving strategie met een naald en een spuit, zoals beschreven in dit protocol, of met behulp van een vortex aanpak en gescheiden met hellingen van Percoll (14, 15) of wervelende zoals blijkt in dit artikel. Deze twee technieken voor het bereiden van schistosomules zijn prachtig beschreven door Fred Lewis (16) en meer informatie voor de verdere kweken van schistosomules voor groei op lange termijn kan worden gevonden op de NIAID schistosome Resource Center ( www.schisto-resource.org ).
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit project werd gefinancierd door de Case Western Reserve University opstarten fondsen verstrekt aan E. Jolly. Geïnfecteerde slakken werden verstrekt door de schistosome Resource Center, NIH-NIAID (NIAID Contract No HHSN272201000009I). We danken ook Chris King en Ronald Blanton voor ondersteuning bij het veiligstellen van geïnfecteerde schistosome slakken en voor nuttige discussies.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | |
| 22g x 2-7/8 "Emulgeren naald | Fisher Scientific | 14 tot 825-17G | |
| RPMI 1640 medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| Foetaal runderserum (FBS) warmte geïnactiveerd | Invitrogen | 10082139 | |
| Penicilline / streptomycine (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Kristalliseren Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D | |
| General Purpose pincet | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Petco Aquarium net voor artemia | Petco | SKU: 1190954 |
Referenties
- Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. Schistosomiasis. N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).
- Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).
- Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis. Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).
- King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis. Lancet. 365, 1561-159 (2005).
- Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology. 124, 153-167 (2002).
- Grabe, K., Haas, W. Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration. Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).
- Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni. J Parasitol. 58, 476-480 (1972).
- Saladin, K. S. Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes. J Parasitol. 68, 120-124 (1982).
- Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum. Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).
- Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes. PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing. J Parasitol. 67, 179-185 (1981).
- Yoshino, T. P. &, Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J Parasitol. 81, 714-722 (1995).
- Colley, D. G., Wikel, S. K. Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules. Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).
- Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll. Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).
- Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules. Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).
Herprints en machtigingen
