De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt

Summary

Een methode om translationeel actief, intact synaptoneurosomes (SNS) voor te bereiden van de hersenen van muizen cortex wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt waardoor voor de snelle bereiding van actieve SNS.

Abstract

Synaptoneurosomes (SNS) zijn verkregen na homogenisering en fractionering van muizenhersenen cortex. Ze worden opnieuw verzegeld blaasjes of geïsoleerd terminals die los te maken van axon terminals als de corticale weefsel wordt gehomogeniseerd. De SNS behoudt pre-en postsynaptische eigenschappen, waardoor ze nuttig zijn in de studie van de synaptische transmissie. Zij behouden de moleculaire machines gebruikt in de neuronale signalering en zijn in staat van opname, opslag en afgifte van neurotransmitters.

De productie en isolatie van actieve SNS kan problemen opleveren met behulp van media, zoals Ficoll, die kunnen worden cytotoxische en vereisen uitgebreid centrifugeren door de hoge dichtheid, en filtratie en centrifugeren methoden, die kan in lage activiteit resultaat als gevolg van mechanische schade van de SNS. Echter, het gebruik van discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënten aan SNS isoleren biedt een snelle methode om een ​​goede opbrengst van translationeel actief SNS produceren. De Percoll-sucrose gradiënt methode is snel en zacht als zij in dienst isotone omstandigheden, heeft minder en kortere centrifugeren spins en vermijdt centrifugeren stappen die pellet SNS en mechanische schade.

Protocol

1. Voorbereidingen ^1-4

1. Bereid 500 ml gradiënt medium (GM) buffer door het mengen van 50 ml van een 2,5 M sucrose slurry, 2,5 ml van een 1 M Tris-HCl, pH 7,5 voorraad, en 0,1 ml van een 0,5 m EDTA, pH 8,0 voorraad met milli- Q water om het volume. Filter steriliseren van de oplossing, hoeveelheid en opslaan van bevroren.
2. Bereid een 1000x voorraad tetrodotoxine (TTX) door het maken van een een mM oplossing in milli-Q H ₂ O. Aliquots van TTX kan worden opgeslagen bij -20 ° C.
3. Bereid 10x Stimulatie Buffer door het maken van een oplossing van 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na ₂ HPO _4, 4 mM KH ₂

Discussion

De discontinue Percoll-sucrose gradiënt bereiding hierin beschreven is een snelle, betrouwbare methode om actief SNS, die gebruikt kunnen worden in een verscheidenheid van synaptische transmissie experimenten te isoleren. Dit verloop methode, die is gebaseerd op de methode ontwikkeld door Dunkley et al.., ^3,4 is een subcellulaire hersenen fractionering procedure, die zowel pre-en postsynaptische membraan-afgeleide blaasjes die geassocieerd zijn met elkaar isoleert. Zonder verdere zuivering van deze SNS zijn c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Micro BCA Protein Assay Kit	Doorboren	23235
CaCl 2	Visser	C79-500
CO 2-gas	Airgas (UW-MDS)	CD 50
EDTA	RPI	E57020
EtOH	Visser	A407SK-4
HCl	Visser	A142-212
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
KH 2 PO 4	Visser	P285-500
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit	Doorboren	89888
NaCl	RPI	S23020
NaHCO 3	Visser	BP328-500
Na 2 PHO 4	Visser	S381-500
Sucrose	RPI	S24060
Tris Base	RPI	T60040
Tetrodotoxine	Sigma	T5651
Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag	Perkin Elmer	NEG772
Uitrusting	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Dissectie-instrumenten
Dounce homogenisator, 7 ml (wordt geleverd met twee glazen stampers met het label "A" en "B")	Wheaton
P1000 Gilson Pipetman	Gilson	F123602
Allegra 6KR Centrifuge	Beckman Coulter	366830
GH 3,8 Rotor, Swinging emmer rotor	Beckman Coulter	360581
Beckman J2-21 Centrifuge	Beckman
Beckman buizen met doppen	Beckman	355672
Wit ommuurde adapters	Beckman	342327
Blauw ommuurde adapters	Beckman
JA-17 Rotor, vaste-hoek rotor	Beckman	369691

Naam van het antilichaam	Vennootschap	Catalogus nummer	Gastheersoort	Verdunningsfactor
β-actine	Sigma	A5441	muis	1:2000
GFAP	Santa Cruz	sc-65343	muis	1:200
GP73	Santa Cruz	Sc-134509	konijn	1:200
HSC70	Santa Cruz	sc-7298	muis	1:200
Laminβ	Santa Cruz	Sc-6261	geit	1:200
Prohibitin	Santa Cruz	sc-28259	konijn	1:200
PSD95	Millipore	MAB1596	muis	5 ug / ul
SNAP25	AbCam	ab5666-100	konijn	1:2000
Synaptofysine	Millipore	MAB368	muis	1:500
β-3-tubuline	Santa Cruz	sc-80016	muis	1:200