De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt

Summary

Een methode om translationeel actief, intact synaptoneurosomes (SNS) voor te bereiden van de hersenen van muizen cortex wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt waardoor voor de snelle bereiding van actieve SNS.

Abstract

Synaptoneurosomes (SNS) zijn verkregen na homogenisering en fractionering van muizenhersenen cortex. Ze worden opnieuw verzegeld blaasjes of geïsoleerd terminals die los te maken van axon terminals als de corticale weefsel wordt gehomogeniseerd. De SNS behoudt pre-en postsynaptische eigenschappen, waardoor ze nuttig zijn in de studie van de synaptische transmissie. Zij behouden de moleculaire machines gebruikt in de neuronale signalering en zijn in staat van opname, opslag en afgifte van neurotransmitters.

De productie en isolatie van actieve SNS kan problemen opleveren met behulp van media, zoals Ficoll, die kunnen worden cytotoxische en vereisen uitgebreid centrifugeren door de hoge dichtheid, en filtratie en centrifugeren methoden, die kan in lage activiteit resultaat als gevolg van mechanische schade van de SNS. Echter, het gebruik van discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënten aan SNS isoleren biedt een snelle methode om een ​​goede opbrengst van translationeel actief SNS produceren. De Percoll-sucrose gradiënt methode is snel en zacht als zij in dienst isotone omstandigheden, heeft minder en kortere centrifugeren spins en vermijdt centrifugeren stappen die pellet SNS en mechanische schade.

Protocol

1. Voorbereidingen ^1-4

1. Bereid 500 ml gradiënt medium (GM) buffer door het mengen van 50 ml van een 2,5 M sucrose slurry, 2,5 ml van een 1 M Tris-HCl, pH 7,5 voorraad, en 0,1 ml van een 0,5 m EDTA, pH 8,0 voorraad met milli- Q water om het volume. Filter steriliseren van de oplossing, hoeveelheid en opslaan van bevroren.
2. Bereid een 1000x voorraad tetrodotoxine (TTX) door het maken van een een mM oplossing in milli-Q H ₂ O. Aliquots van TTX kan worden opgeslagen bij -20 ° C.
3. Bereid 10x Stimulatie Buffer door het maken van een oplossing van 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na ₂ HPO _4, 4 mM KH ₂ PO _4, 40 mM NaHCO _3, en 800 mM NaCl in milli-Q water. Voorraad kan worden opgeslagen bij 4 ° C.
4. Pre-cool centrifuges tot 4 ° C.
5. Bereid een voorraad oplossing van Isosmotic Percoll (SIP) door toevoeging van negen volumes van Percoll (18 ml) tot een volume van 2,5 M sucrose (2 ml) in milli-Q water en meng goed.
6. De voorbereiding van de drie, 10, 15, en 23% helling lagen door het toevoegen van de respectievelijke bedragen van SIP naar GM buffer en het mengen van elk:

7. Giet helling lagen door pipetteren 2 ml van elk van de 23, 15, 10, en 3% isosmotic Percoll oplossingen in de Beckman centrifuge buizen met doppen met een P1000 Gilson Pipetman. De interface tussen de lagen moet duidelijk waarneembaar, zonder vermenging van de lagen. Bewaar de hellingen bij 4 ° C gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik. De gradiënten kunnen worden opgeslagen voor tot 24 uur, hoewel dezelfde dag gebruik wordt aanbevolen. [Onervaren laboratorium personeel kan de praktijk voorbereiden gradiënten door het toevoegen van blauwe kleurstof om de isomotic Percoll oplossingen voor visualisatie van de laag interfaces.]

2. Muis dissectie ^een

1. Zorg ervoor dat alle muizen veeteelt en euthanasie worden uitgevoerd in overeenstemming met NIH en de Universiteit richtlijnen. Euthanaseren pups (leeftijd P13 tot P21) door kooldioxide stikken of door een goedgekeurde methode van in het dier protocol.
2. Speld de muis om een ​​dissectie raad van bestuur en spuit de achterkant van de nek en hoofd met ethanol. Met behulp van een scherpe schaar snijden door het ruggenmerg aan de basis van de schedel, verwijder de huid van de bovenkant van de schedel, zijdelings snijden de schedel tussen de pariëtale bot en de interparietal bot of tussen de hersenen en de cortex regio's. Knip dan de schedel van de basis naar de neus (langs de sagittale hechting), verwijder voorzichtig de zachte pariëtale bot door te trekken elk halfrond aan de zijkant en verwijder de cortex met een spatel. Plaats de spatel in de hersenen boven het cerebellum en dan schep de cortex en plaats het in ijskoude GM buffer. Ga direct naar de homogenisering stap. Laat niet de cortex zitten in ijskoude buffer voor zeer lang, omdat dit nadelige gevolgen zal de vorming van SNS beïnvloeden.

3. Voorbereiding van homogenaat en SNS ^1-4

1. Spoel de cortex in de ijskoude GM buffer en overdracht twee cortex om een ​​glas Dounce homogenisator met 5 ml koud GM buffer.
2. Voorzichtig gehomogeniseerd de cortex met 5-10 slagen van de losse stamper (pestle "A"), gevolgd met 5-10 slagen van de krappe stamper (pestle "B"). Slagen moet snel, maar langzaam genoeg niet om luchtbellen te veroorzaken. Een foto van de homogenaat na homogenisering is in Schema 1. Het aantal slagen zal variëren afhankelijk van de individuele homogenisator en bijbehorende stampers. Wanneer u klaar bent de hellingen moet een sterke band SN te geven, zo niet, pas het aantal slagen.
3. Breng de homogenaat om een ​​15 ml conische en centrifugeer bij 1000xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een swingende emmer rotor (Allegra 6KR centrifuge) om pellet cellulaire puin en kernen. Een foto van de gesponnen homogenaat wordt in Schema 1.
4. Laag 2 ml van de bovenstaande per Percoll-sucrose gradiënt, cap de buizen, en centrifugeer bij 32.500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C in een vaste hoek rotor (Beekman J2-21 centrifuge, JA-17 rotor) met behulp van geschikte adapters ( Zie Reagentia en apparatuur tabel).
5. Pipet uit en gooi de oplossing boven de SN band met een glazen Pasteur pipet. Pipet uit de SN band op de 15/23%-interface, transfer naar een conische en op te slaan op het ijs. Elke verloop of een cortex zal produceren 0.9-1.1 mL van SN.
6. Pas de zoutconcentratie van het SNS door de toevoeging van een tiende volume van 10x stimulatie buffer, voeg 1000x CaCl ₂ tot een uiteindelijke concentratie van 12 nM, en 1 mM TTX voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM toe te voegen aan niet-specifieke excitatie te onderdrukken. (Toevoeging van CaCl ₂ is optioneel indien het zal interfereren met downstream SN toepassingen).
7. Bepaal de eiwitconcentratie van de SNS met behulp van de Micro BCA Protein Assay Kit. (De Bradford proteïne test is niet aan te raden vanwege de gevolgtrekking uit de Percoll.)
8. SNS kan direct en snel worden gebruikt voor de eiwit-vertalingTIE studies. Voor andere toepassingen SN lysaat kan worden opgeruimd of geconcentreerd met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit.

4. Representatieve resultaten:

Wanneer de muis cortex werd gehomogeniseerd en gescheiden op discontinue Percoll-sucrose gradiënten (Schema 1), 6 bands of fracties werden gezien (figuur 1). Het was eerder al aangetoond voor rat cerebrale cortex ^3,5 dat de bestanddelen van het hoge moleculair gewicht banden werden membraan en myeline gebroken en dat het ingehulde materiaal mitochondriën of organellen (tabel 1). De 23% / 15%-interface (Band 5) bevatte de verrijkte SNS.

De band van de 23% / 15%-interface, met intact SNS, werd verwijderd en onderzocht met behulp van elektronenmicroscopie (EM), zoals eerder beschreven. ^2,6 EM de aanwezigheid van intacte synaptische blaasjes en het behoud van de presynaptische en postsynaptische elementen (figuur zien 2). Isolatie van pre-en postsynaptische compartimenten is belangrijk voor de behandeling van signalering en eiwitsynthese, die voorkomt in beide compartimenten. ^7-13 De Percoll-sucrose gradiënt is een ruwe zuivering, zodat we zagen kleine cellulaire, nucleaire en organel besmetting in de SN-fractie, maar de de totale scheiding was goed.

Wanneer onderzocht door Western blot, de Percoll fracties die het verwachte eiwit markers met een toename van de synaptische zuiverheid in de SN band (figuur 3, tabel 2). Synaptische en neuronale markers werden gehandhaafd in de verrijkte SN band (Band 5), maar de overvloed van andere markers werd aanzienlijk verminderd. Met name de aanwezigheid van GFAP, een marker voor astrocyten en neoplastische cellen van gliale oorsprong, en Lamin-B1, een nucleaire marker, waren te verwaarlozen, terwijl structurele en synaptische markers werden gehandhaafd of verbeterd. Daarnaast was er het behoud van markers voor organellen, zoals de mitochondria en het Golgi, die een rol spelen in de eiwitsynthese.

Typische rendementen voor de SN band waren 250-500 ng van eiwit per microliter, zoals bepaald door BCA eiwit-test. De activiteit van de SNS werd bepaald door het bedrag van de novo eiwitsynthese te presenteren als gecontroleerd door [35S]-Met incorporatie (figuur 4). ² Basal translationeel activiteit werd verhoogd 1,56 voudig indien SNS werden gestimuleerd met 50 uM glutamate/10 uM glycine (Glu) of 5,12 folden als geactiveerd met de Pin1 remmer juglone. Pin1 remming is bekend dat leiden tot een verhoogde proteïnesynthese. ² Om te bevestigen dat de verhoging van [35S]-Met opname was te wijten aan de novo eiwitsynthese, voegden we 40 uM anisomycin, een eiwitsynthese remmer, en zag een duidelijke afname in oprichting in de aanwezigheid en afwezigheid van Glu in vergelijking met basale niveaus. Tevens, op de toevoeging van 2% Triton-X 100, die de integriteit van de SNS verstoort, was basale vertaling daalde met 75%. ² Ook bij het ​​onderzoek van de banden (B4-B6) die de meeste synaptische marker verrijking zien, De SNS-of Band 5 had de grootste activiteit voor de novo eiwitsynthese (figuur 5). Zo is het discontinue Percoll-sucrose gradiënten snel een zeer actief en verrijkt SN band die kan worden gebruikt om eiwit vertaling te bestuderen.

De discontinue Percoll-sucrose gradiënt procedure is voordeliger dan andere methoden, omdat mechanische schade is veroorzaakt door zwaardere omstandigheden. In vergelijking met de filtratie-methode, waarbij gewist corticale homogenaat wordt door een reeks filters die afnemen in grootte, ^3,14-15 de Percoll methode meer SNS vormen met een grotere activiteit. Zoals te zien in Figuur 6, wanneer een hoeveelheid van SNS opgesteld door de filtratie methode was gepasseerd een Percoll-sucrose gradiënt zijn er veel minder SNS op de 15/23%-interface en een grotere hoeveelheid van gebroken vliezen. Wanneer de novo eiwitsynthese werd gemeten via een S35-met oprichting, de SNS opgesteld door de filtratie methode waren veel minder actief (figuur 7). Voor een maximale translationele activiteiten gebruiken we muizen die tussen de leeftijd van P14 en P18. SN kunnen worden bereid uit volwassen muizen, maar zagen we aanzienlijk toegenomen translationele activiteit met SN bereid uit juvenile muizen (figuur 8).

Tabel 1. Bestanddelen van de bands uit de discontinue Percoll-gradiënt fractioneringen van gehomogeniseerde muis cortex. ^3,5

Tabel 2. Samenvatting van de westerse bout de analyse van discontinue Percoll-sucrose gradiënt band bestanddelen. Relatieve eiwitconcentraties voor elk van de band fracties geïsoleerd met behulp van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt werden bepaald door Western blot. Geen eiwit aanwezig is (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), of> 0,8 (+++) maal groter waren dan eiwit aanwezig is in de supernatant (S, gecentrifugeerd cortex homogenaat), vertegenwoordiger van n = 3.

Schema 1: Schema van een SN preparaat met behulp van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt Mouse hersenen cortex werden ontleed, gehomogeniseerd, en gecentrifugeerd op lage snelheid niet-gehomogeniseerd weefsel, cellen, hele organellen zoals de kernen en membranen te verwijderen.. De discontinue gradiënt moet duidelijk gedefinieerde lagen. De foto inzet toont een voorbeeld van de lagen, die zijn geverfd blauw alleen voor illustratieve doeleinden, om de lagen te visualiseren. Het supernatant is gelaagd op de top van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt en gecentrifugeerd bij gemiddelde snelheid. De SN band wordt dan opgehaald van de helling en is klaar voor gebruik.

Figuur 1. Homogenaat fractionering op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt. Muis cortex werd gehomogeniseerd en gescheiden op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt die aanleiding geeft tot zes bands of fracties. Het gezuiverde, actieve SNS (*) zijn gevonden in Band 5.

Figuur 2. SN voorbereidingen geven een heterogene mix van SNS dat de presynaptische en postsynaptische elementen te behouden. Een electronen microscoop foto van een SN preparaat bereid uit C57BL / 6 muizen (leeftijd P13 tot P21) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven en toont SNS met gekonfijte presynaptische en postsynaptische elementen ^{2. , 6} rode pijlen wijzen naar post-synaptische dichtheden. Schaal bar is 1 micrometer.

Figuur 3. Western blot analyses van SN de voorbereidingen bleek dat synaptische en neurale markers werden behouden in het gezuiverde SNS (Band 5), maar de overvloed van andere markers werd aanzienlijk verminderd. Immunoblots van het supernatans (S, gecentrifugeerd corticale homogenaat) en Bands 1-6 van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt werd gesondeerd voor β-actine (structurele, laden controle), GFAP (astrocytaire), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplasmatische en nucleaire), Lamin-B1 (nucleaire), Prohibitin (mitochondriale), PSD95 (postsynaptische dichtheid ), SNAP25 (synaptic), synaptofysine (synaptic) en β3-tubuline (neuron-specifieke). De bands werden gevisualiseerd met behulp van een Storm 860 Phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3.

Figuur 4. SNS zijn actief en vertonen de novo eiwitsynthese via [35S]-Met de oprichting. SNS waren pre-evenwicht gebracht tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan is de Sns waren onbehandeld of voorbehandelde gedurende 15 minuten met 40 uM anisomycin of 1 uM juglone bij 37 ° C gevolgd door toevoeging van [35S]-Met, 20 ul Express Pro Label S35 Gemakkelijk Tag Mix, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM.

Figuur 5. Band 5 van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt bevat de hoogste niveaus van de novo eiwitsynthese. Banden 4, 5 en 6 en de supernatant (S, gecentrifugeerd corticale homogenaat) waren vooraf geëquilibreerd tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan, [35S]-Met, Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag, werd toegevoegd, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM.

Figuur 6. SNS bereid uit een filtratie methode bevat meer gebroken vliezen en minder dan hele SNS SNS bereid uit de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode. SNS werden voorbereid door het passeren gehomogeniseerd cortex door een reeks van filters met afnemende poriegrootte zoals eerder beschreven. ^3,14-15 Een deel van de SNS opgesteld door de filtratie methode werd gecentrifugeerd op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt en in vergelijking met een gelijkwaardig bedrag van materiaal met behulp van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode.

Figuur 7. SNS bereid uit een filtratie methode bevat minder de novo eiwitsynthese activiteit dan SNS weer bereidm de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode. SNS werden voorbereid door het passeren gehomogeniseerd cortex door een reeks van filters met afnemende poriegrootte zoals eerder beschreven, ^3,14-15 en door de discontinue Percoll-sucrose gradiënt methoden. SNS van beide preparaten waren pre-evenwicht gebracht tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan, [35S]-Met, Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag, werd toegevoegd, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM.

Figuur 8. SNS van jongere muizen (P14) hebben een grotere translationeel activiteit dan oudere muizen (P85). SNS werden bereid uit verschillende oude muizen met behulp van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode, preequilibrated bij 37 ° C gedurende 10 min, behandeld of onbehandeld met Glu in het aanwezigheid van [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Eenvoudige Tag) gedurende 30 min, snap ingevroren en later schoongemaakt met de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. De SNS werden vervolgens draaien op een 12% SDS-polyacrylamide gel, gedroogd en afgebeeld op een Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM. SNS vanaf P14 muizen werden minstens 3-maal meer actief dan P85 muizen.

Discussion

De discontinue Percoll-sucrose gradiënt bereiding hierin beschreven is een snelle, betrouwbare methode om actief SNS, die gebruikt kunnen worden in een verscheidenheid van synaptische transmissie experimenten te isoleren. Dit verloop methode, die is gebaseerd op de methode ontwikkeld door Dunkley et al.., ^3,4 is een subcellulaire hersenen fractionering procedure, die zowel pre-en postsynaptische membraan-afgeleide blaasjes die geassocieerd zijn met elkaar isoleert. Zonder verdere zuivering van deze SNS zijn c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Micro BCA Protein Assay Kit	Doorboren	23235
CaCl 2	Visser	C79-500
CO 2-gas	Airgas (UW-MDS)	CD 50
EDTA	RPI	E57020
EtOH	Visser	A407SK-4
HCl	Visser	A142-212
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
KH 2 PO 4	Visser	P285-500
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit	Doorboren	89888
NaCl	RPI	S23020
NaHCO 3	Visser	BP328-500
Na 2 PHO 4	Visser	S381-500
Sucrose	RPI	S24060
Tris Base	RPI	T60040
Tetrodotoxine	Sigma	T5651
Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag	Perkin Elmer	NEG772
Uitrusting	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Dissectie-instrumenten
Dounce homogenisator, 7 ml (wordt geleverd met twee glazen stampers met het label "A" en "B")	Wheaton
P1000 Gilson Pipetman	Gilson	F123602
Allegra 6KR Centrifuge	Beckman Coulter	366830
GH 3,8 Rotor, Swinging emmer rotor	Beckman Coulter	360581
Beckman J2-21 Centrifuge	Beckman
Beckman buizen met doppen	Beckman	355672
Wit ommuurde adapters	Beckman	342327
Blauw ommuurde adapters	Beckman
JA-17 Rotor, vaste-hoek rotor	Beckman	369691

Naam van het antilichaam	Vennootschap	Catalogus nummer	Gastheersoort	Verdunningsfactor
β-actine	Sigma	A5441	muis	1:2000
GFAP	Santa Cruz	sc-65343	muis	1:200
GP73	Santa Cruz	Sc-134509	konijn	1:200
HSC70	Santa Cruz	sc-7298	muis	1:200
Laminβ	Santa Cruz	Sc-6261	geit	1:200
Prohibitin	Santa Cruz	sc-28259	konijn	1:200
PSD95	Millipore	MAB1596	muis	5 ug / ul
SNAP25	AbCam	ab5666-100	konijn	1:2000
Synaptofysine	Millipore	MAB368	muis	1:500
β-3-tubuline	Santa Cruz	sc-80016	muis	1:200