Method Article

Toepassing van een muis geligateerd Peyer's Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

DOI:

10.3791/3225

December 17th, 2011

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door M-cellen In vivo. Deze methode biedt een methode om de M-cel functie te begrijpen in het immuunsysteem.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De binnenkant van onze darmen wordt bewoond met een enorm aantal van de commensale bacteriën. De mucosale oppervlak van het maag-darmkanaal is continu blootgesteld aan hen en af ​​en toe aan pathogenen. De darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) spelen een belangrijke rol voor de inductie van de mucosale immuunrespons op deze microben 1, 2. Tot inleiding van de mucosale immuunrespons, moet de mucosale antigenen worden vervoerd van de darm lumen over de epitheliale barrière in georganiseerde lymfoïde follikels zoals de plaques van Peyer. Dit antigeen transcytose wordt gemedieerd door gespecialiseerde epitheliale cellen M 3, 4. M-cellen zijn atypische epitheelcellen die actief fagocyteren macromoleculen en microben. In tegenstelling tot dendritische cellen (DC's) en macrofagen, die zich richten op antigenen te lysosomen voor degradatie, M cellen voornamelijk transcytose de geïnternaliseerde antigenen. Deze krachtige macromoleculaire transcytose door M cellen levert antigeen naar de onderliggende organisatie lymfoïde follikels eend wordt verondersteld essentieel te zijn voor het initiëren antigeen-specifieke mucosale immuunrespons. Echter, de moleculaire mechanismen ter bevordering van dit antigeen opname door M-cellen zijn grotendeels onbekend. We hebben eerder gemeld dat glycoproteïne 2 (GP2), in het bijzonder uitgedrukt op de apicale plasmamembraan van de M-cellen onder de enterocyten, dient als een transcytotic receptor voor een subset van commensale en pathogene enterobacteriën, waaronder Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium ), door het herkennen FimH, een component van type I pili op het bacteriële buitenste membraan 5. Hier presenteren we een methode voor de toepassing van de pleister een muis Peyer's intestinale loop-test voor bacteriële opname te evalueren door M-cellen. Deze methode is een verbeterde versie van de muis intestinale loop test eerder beschreven 6, 7. De verbeterde punten zijn als volgt: 1. Isofluraan werd gebruikt als een anestheticum. 2. Ongeveer 1 cm geligeerde darm-lus inclusiefING Peyer's patch werd opgericht. 3. Bacteriën door M cellen genomen werden fluorescent gelabeld door fluorescentie etikettering reagens of door overexpressie fluorescerend eiwit zoals groen fluorescerend eiwit (GFP). 4. M-cellen in de follikel-geassocieerde epitheel die Peyer's patch werden gedetecteerd door middel van volledige mount immunostainig met anti GP2 antilichaam. 5. Fluorescerende bacteriën transcytose door M-cellen werden waargenomen door confocale microscopische analyse. De muis Peyer's patch intestinale loop-test zou kunnen leveren is het antwoord wat voor soort commensale of pathogene bacteriën transcytosed door M-cellen, en kan ons naar het moleculaire mechanisme van hoe mucosale immuunsysteem te stimuleren door middel van M cellen te begrijpen leiden.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de bacteriële cellen

  1. Streak glycerol gevulde fluorescerende bacteriën (zoals GFP uiten van S. Typhimurium) op LB-agar een plaat met 100 ug / ml ampicilline.
  2. Cultuur een enkele kolonie van LB agar 's nachts in 2 ml van de nieuwe LB-medium.
  3. Voeg 0,5 ml van de bacteriecultuur tot 4,5 ml van de nieuwe LB medium en incubeer tot de optische dichtheid van 1.0 bij 600 nm is bereikt.
  4. Oogst bacteriële cellen door centrifugeren (3000 xg, 5 min, 4 ° C).
  5. Verwijder het supernatant en was tweemaal met 5,0 ml van de steriele fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
  6. Resuspendeer bacteriële pellet....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriële suspensie wordt meestal gedurende 1 uur om de bacteriële opname te observeren in de M-cellen. In het geval van 4 uur incubatie worden de bacteriën vaak gedetecteerd in de T cel zone van de plaques van Peyer. Omdat de verdampte isofluraan inhalatie-anesthesie kon houden muizen stabiel, de incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriesuspensie is uitbreidbaar naar de bacteriën die verhuizen naar T-cel-zone in patch Peyer te observeren. Het bela.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag alle EIB-leden bedanken voor het ontwikkelen van deze techniek. Dit onderzoek werd mede ondersteund door Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek op prioritaire gebieden "Membrane Traffic" (HO), en de "Matrix van infectieuze Phenomena" (KH), Young Scientists (SF en KH), en Wetenschappelijk Onderzoek (HO ), en Wetenschappelijk Onderzoek over innovatieve Areas "Intracellulaire Logistics" (HO), van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Naam van het reagens Vennootschap Catalogus nummer Commentaar (optioneel)
LB agar Ampicilline-
100
SIGMA L5667
Cy3 mono-Reactive
Dye Pack
GE Healthcare PA23001
Alexa Fluor 350
carbonzuur,
succinimidylester
Invitrogen A10168
Inhalatie-anesthesie
apparaat
Shinano Seisakusho SN-487
Fixatie en
Permeabilisatie
Oplossing
BD 554722
Anti-muis
Glycoproteïne 2
antilichaam
MBL D278-3 200-voudige verdunning (5μg/ml)
Geit anti-rat IgG,
F (ab ') 2 fragment
specifiek
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200-voudige verdunning (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Phalloidin
Molecular Probes A22284 50-voudige verdunning
Confocale laser
scanning microscoop
Leica Microsystems DMIRE2
DeltaVision
Restauratie
deconvolutie
microscoop
Toegepaste Precision DeltaVision Core

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Scienc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

M CellsPeyer s PatchBacterial UptakeIntestinal Loop AssayConfocal MicroscopyGp2 AntibodyFluorescent BacteriaMucosal ImmunityStromal Vascular FractionCell Isolation

Related Articles