Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica</em

Samenvatting

Wij bieden een kosteneffectieve en snelle moleculaire genotypering protocol dat ras-specifieke PCR-primers werken die zich richten op DNA-sequentie verschillen binnen de chloroplast trnL-F spacer regio onderscheid te maken tussen soorten Imperata cylindrica (Cogongrass) die niet kan worden onderscheiden door de morfologie alleen. Deze rassen zijn onder andere de federaal vermeld schadelijke onkruid, cogongrass en de nauw verwante, wijdverbreide decoratieve variëteit, ik. cylindrica Var. Koenigii (Japans bloed gras).

Samenvatting

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is een van de top tien van slechtste invasieve planten in de wereld, een negatieve invloed op de landbouw en de natuurlijke hulpbronnen in 73 verschillende landen in Afrika, Azië, Europa, Nieuw-Zeeland, Oceanië en Zuid-Amerika ^1-2. Cogongrass vormt snel verspreiden, monodominant staat dat een grote verscheidenheid aan inheemse plantensoorten verdringen en op zijn beurt een bedreiging voor de inheemse dieren die afhankelijk zijn van de verdreven inheemse plantensoorten voor voer en onderdak. Toe te voegen aan het probleem, een siertuin variëteit [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] wordt op grote schaal de markt gebracht onder de namen van Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, en Japans bloed gras (JBG). Deze variëteit is vermeende steriel en niet-invasieve en wordt beschouwd als een wenselijke sier voor de rood-gekleurde bladeren. Echter, onder de juiste omstandigheden kan JBG levensvatbare zaden (Carol Holko, 2009 persoonlijke communicatie) en kan terugkeren naar een groene invasive vorm die vaak niet te onderscheiden van cogongrass als het nodig is op de onderscheidende kenmerken van de wild-type invasieve variëteit ⁴ (figuur 1). Dit maakt identificatie met behulp van de morfologie een moeilijke taak, zelfs voor goed getrainde plant taxonomen. Terugkeer van JBG een agressieve groene fenotype is ook geen zeldzaamheid. Met behulp van sequentie vergelijkingen van codering-en variabele regio's in zowel de kern-en chloroplast DNA, hebben we bevestigd dat JBG is teruggekeerd naar het groene invasieve binnen de staten Maryland, South Carolina, en Missouri. JBG is verkocht en geplant in bijna elke staat in de continentale VS, waar er geen actief cogongrass besmetting. De omvang van het probleem in weer niet goed begrepen, want planten zijn teruggekeerd zonder papieren en vaak vernietigd.

De toepassing van deze moleculaire protocol voorziet in een methode om te identificeren JBG terug en kan helpen om deze rassen van co-optreden eenND mogelijk hybridiseren. Cogongrass is een obligate outcrosser en, indien gekruist met een ander genotype, kan produceren levensvatbare wind-verspreide zaden die cogongrass verspreid over grote afstanden ^5-7. JBG heeft een iets ander genotype dan cogongrass en kan in staat zijn om levensvatbare hybriden te vormen met cogongrass. Toe te voegen aan het probleem, JBG is koud en donker tolerant dan cogongrass ^8-10, en de gene flow tussen deze twee soorten is waarschijnlijk hybriden die agressiever te genereren, schaduw tolerant en winterharde dan wild-type cogongrass. Terwijl de wild-type cogongrass momenteel teistert meer dan 490 miljoen hectare wereldwijd, in het zuidoosten VS het teistert meer dan 500.000 hectare en is in staat bezetten het grootste deel van de VS als het zich snel verspreidt naar het noorden vanwege de brede niche en geografische mogelijkheden ^3,7,11. Het potentieel van een genetische kruising is een ernstig probleem voor de USDA-APHIS federale schadelijke weekprogramma. Momenteel is de USDA-APHIS verbiedt JBG in staten whvoordat er grote cogongrass parasitaire aandoeningen (bijv., Florida, Alabama, Mississippi). Kan echter voorkomen dat de twee varianten van een combinatie van moeilijker als cogongrass en JBG breiden hun distributies. Bovendien is de verdeling van de JBG weer is onbekend en zonder het vermogen om deze soorten te identificeren door morfologie sommige cogongrass parasitaire kan het gevolg zijn van JBG terug. Helaas huidige moleculaire identificatiemethoden gewoonlijk afhankelijk AFLP (geamplificeerde fragment lengte polymorfismen) en DNA sequentie, die beide zijn tijdrovend en kostbaar. Hier presenteren we de eerste kosten-effectieve en betrouwbare PCR-gebaseerde moleculaire genotypering methode om nauwkeurig onderscheid te maken tussen cogongrass en JBG terug.

Protocol

1. Specimen verzamelen en bewaren

Deze methode is ontwikkeld en getest met behulp van vers, bevroren, en sinds kort gedroogd blad weefsels.

1. Identificeer cogongrass en / of JBG weefsels met behulp van een taxonoom dat gespecialiseerd is in grassoorten identificatie. De helderrode bladeren sier JBG gemakkelijk visueel te onderscheiden terug van wild-type en cogongrass JBG, maar cogongrass en JBG weer bijna niet van elkaar. Cogongrass en de JBG teruggekeerd fenotype hebben groene, langere bladeren, aanzienlijk groter en langer wortelstokken, en meer bladoppervlakte dan JBG ¹² (figuur 1).
2. Fresh bladweefsel biedt de meest voorkomende en hoogste kwaliteit DNA en kunnen worden verzameld van het veld of in de kas geteeld I. kokervormig planten. Als sel wordt gebruikt, extract DNA binnen 3 uur verzameling om afbraak te voorkomen. Anders, voor te bereiden weefsel voor opslag, keeping het weefsel koel en niet in direct zonlicht.
3. Om weefsels voor DNA-extractie op te slaan op een later tijdstip, de meest optimale methode is te bevriezen en het weefsel op te slaan bij -80 ° C onmiddellijk. Zorg ervoor dat de bevroren weefsel te ontdooien voor DNA-extractie. Breng de bevroren weefsel om vloeibare stikstof voorafgaand aan het slijpen stappen van DNA-extractie om te voorkomen dat het ontdooien.
4. Als een -80 ° C vriezer niet beschikbaar is, droog het weefsel onmiddellijk. Voor droge opslag plaats het weefsel in een papier enveloppe en slaan de enveloppe in gedehydrateerde silica gel of andere actieve droogmiddelen bij kamertemperatuur. Een kleine hoeveelheid silica indicator gemengd met niet-aangegeven silica zorgt ervoor dat silica volledig gedehydrateerd en voor drooginstallatie weefsel.
5. Gebruik van ten minste 10 keer silicagel dan verse bladweefsel gew. Plantenweefsel, drogen binnen 24 uur. De kwaliteit en kwantiteit van DNA wordt verminderd door droog opslag gedurende tijd (bij herbarium monsters).

2. DNA-extractie

Om DNA te extraheren uit plantenweefsel, volg dan de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69104 of 69106) instructies van de fabrikant met een kleine wijziging. In plaats van de voorgestelde minder dan 100 mg sel of minder dan 20 mg droog weefsel voor elke kolom malen groter dan 100 mg en 100 mg overbrengen van verse of bevroren weefsel (of> 20 mg van droog weefsel) passende buizen voor extractie. Nuclear en plastide DNA gelijktijdig geëxtraheerd.

1. Voordat u deze procedures, controleert u of ethanol is toegevoegd aan buffers AP3 / E en AW.
2. Gemalen> 100 mg van verse of bevroren bladweefsel (of> 20 mg droog bladweefsel) tot een fijn poeder met drie rondes van vloeibare stikstof malen in een gekoelde vijzel. Onvoldoende verstoring van het uitgangsmateriaal of onvoldoende lysis kan ook leiden tot lagere opbrengsten van het DNA. Voorzichtig maal de Tissue en niet te veel de kolommen met te veel weefsel.
3. Breng 100 mg bevroren poeder uit vers bevroren of weefsel (of 20 mg van poeder uit droog weefsel) met een 1,5 ml microcentrifugebuisje met 400 ul Buffer AP1 en 4 pi RNase A. Elk buis in een rek geplaatst worden op een evenwicht op het juiste gewicht van het weefsel per buis te controleren.
4. Vortex of schud monster (s) te mengen en incuberen gedurende 10 min bij 65 ° C, het buisje (s) 2-3 maal gedurende incubatie.
5. Voeg 130 ul buffer AP2 aan elk monster. Meng door het buisje (s) meerdere keren, en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
6. Pipet elk lysaat in een aparte QIAshredder Mini spin-kolom, en leg elke kolom in een 2 ml verzamelbuis (voorzien van de kit). Centrifuge kolom (men) gedurende 2 min bij 20.000 xg (~ 14.000 rpm), en breng elke flow-through fractie in een nieuwe buis (niet meegeleverd met de kit) zonder verstoring van eventueel gevormde pellet.
7. Voeg 1,5 volumes buffer AP3 /E, en mengen door pipetteren.
8. Breng 650 pi van het mengsel in een DNeasy Mini draai kolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) en gooi de doorstroming. Herhaal stap met het resterende mengsel van elk monster.
9. Plaats de spin kolom (s) in een nieuwe 2 ml verzamelbuis (s) en voeg 500 ul Buffer van AW naar de top van elke kolom. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) en gooi doorstroming.
10. Voeg nog een 500 pi van buffer AW naar de top van elke kolom. Centrifugeer 2 min bij 20.000 xg (~ 14.000 rpm). Deze stap droogt de kolom, waardoor elke resterende ethanol in de buffers die remmen PCR.
11. Overdracht elke spin kolom naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis monsterbuis. Voeg 100 ul Buffer AE naar de top van elke kolom voor elutie en incuberen kolom (s) 5 min bij kamertemperatuur. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) het DNA te verzamelen.
12. Herhalen elutie stappen een keer, elueren de DNA in dezelfde 1,5 ml microcentrifugebuisje tot 200 ul van het monster te verkrijgen. Winkel DNA bij -20 ° C tot gebruik. DNA-concentraties afhankelijk weefseltype en opslag. Optimale opbrengsten worden verkregen wanneer geëlueerd DNA met een totaal van 200 pi buffer AE, maar concentraties kan worden verhoogd als elutievolume gereduceerd tot slechts 50 pi.

3. Verificatie van de DNA-Kwaliteit en kwantiteit

1. Test de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerd DNA voorafgaand aan PCR setup met behulp van een spectrofotometer of fluorometer en gel elektroforese. Dit zal helpen waarborgen het succes van de volgende stappen.
2. Met behulp van een spectrofotometer, test-DNA-kwaliteit en kwantiteit. Goede opbrengsten DNA moet tussen 50 en 150 ng / pl met 260/280 230/280 verhoudingen nabij 2,0. Als voorbeeld figuur 2 goede resultaten met de NanoDrop spectrofotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE).
3. Voer elektroforese met een standaard 1% agarose gel. Controleer de aanwezigheid van relatief grote banden (> 10 Kb) zonder weinig strepen van RNA verontreiniging (figuur 3).
4. Als de DNA-concentratie hoog is, verdund DNA monsters 70 ng / pl voor latere stappen.

4. PCR primers

De PCR-primers die in dit protocol zijn gebaseerd op de volgorde verschillen tussen de plastide trnL-F spacer regio cogongrass en JBG genotypen. Deze verschillen komen in de vorm van SNPs (single nucleotide polymorphisms) en indels (Invoegen en verwijderen) dat de ontwikkeling van verschillende-specifieke primers door het lokaliseren van de primers op de sites van unieke sequenties (figuur 4) toegestaan.

1. De kwaliteit van de primers kan een aanzienlijke invloed op de PCR resultaten. Bestel primers van een gerenommeerd bedrijf. We bestellen onze primers van Oblique Bio, Inc (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), met het verzoek alleen standaard ontzouting procedures.
2. trnL-F positieve controle primers: Deze primer set versterkt de plastide trnL-F spacer regio van de meeste gras taxa ^11-13 en dient als een goede positieve controle (wat resulteert in een 890 bp band).
   

   Naam	Volgorde
   trnF (GAA)-F	5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 '
   trnL (5 'exon)-C	5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 '

3. Wild-type cogongrass primers: Deze primer set specifiek cogongrass en niet versterkt de trnL-F regio JBG genotypes. De set resulteert in een band die 595 bp.
   

   Naam	Seqnvloeden
   trnLF-C-F1	5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 '
   trnLF-C-R1	5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 '

4. JBG en JBG Terugkeren primers: Deze primer set is specifiek voor JBG genotype en niet versterken de trnL-F regio cogongrass. De set resulteert in een band die 594 bp.
   

   Naam	Volgorde
   trnLF-R-F2	5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 '
   trnLF-R-R2	5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 '

5. Resuspenderen elke primer in voldoende hoeveelheid nuclease zonder DDH ₂ O een 100 mM voorraad oplossingen die worden opgeslagen bij -20 ° C, langdurige verkrijgen.
6. Vul telkens primer voorraad tot 12 mm voor de PCR-setup stappen.

5. PCR-Setup

DNA extracties geamplificeerd met elk van de bovenvermelde primersets in PCR-reacties. Voeg een positieve controle om alle PCR reagentia goed functioneren en een band genereren. Voeg een negatieve controle om ervoor te zorgen dat geen van de reagentia zijn verontreinigd met ongewenste DNA. De negatieve controle bevat geen-template en moet resulteren in geen band productie.

1. Bereid alle reacties in dunwandige PCR-buisjes tot een betere warmte-overdracht tussen de thermocycler blok en het monster toe te staan. Wij raden u aan in de handel verkrijgbare spuitbussen zonder pipet tips om besmetting te voorkomen.
2. Voor elke geïsoleerde DNA-monster, dat is opgericht 50 ul PCR-reacties gebruik van elk van de bovenstaande primer sets in 0,2 ml dunwandige PCR-buisjes door toevoeging van de volgende reagentia on Ice in de volgorde hieronder vermeld. Als er meerdere monsters worden voorbereid, maak een cocktail met alle reagentia, met uitzonderingvan de DNA-template aan uniforme voorwaarden tussen alle reacties vast te stellen.
   

   PCR Reagens	Gebruikte volume	Final Concetration
   Nuclease-free DDH 2 O	40,5 ul
   10X Voordeel 2 PCR-buffer (Clonetech, CA)	5,0 pl	10% (v / v)
   Voordeel UltraPure PCR dNTP Mix (10 mM elk, Clonetech, CA)	1,0 pl	0,2 mM
   Primer 1 (12μM in DDH 2 O)	1,0 pl	0,24 uM
   Primer 2 (12μM in DDH 2 O)	1,0 pl	0,24 uM
   Voordeel 2 Polymerase Mix (Clonetech, CA)	0,5 ul	1% (v / v)
   DNA-extractie(70 ng / reactie; aan te passen DDH 2 O volume als nodig)	1,0 pl	1.4 ng / ul
   	Totaal: 50,0 ul

3. Om ervoor te zorgen dat alle PCR-reagentia goed werken, het instellen van de positieve controle met behulp van de positieve controle primers. Deze primer set werkt even goed voor cogongrass, JBG, JBG en terugkeren andere grassen en zal resulteren in een band die is 890 bp.
4. Stel de negatieve controle met behulp van dezelfde controle primer te stellen als de positieve controle, met behulp van DDH ₂ O in plaats van de DNA-extractie. Als alle reagentia zijn vrij van DNA vervuilt, deze reactie zal resulteren in geen band.
5. Als de DNA-concentratie laag is, kan meer DNA worden toegevoegd aan elk reactievat, aanpassen van de hoeveelheid vrij Nuclease DDH ₂ O gebruikt om het totale reactievolume van 50 pi brengen. Gebruik niet meer dan 5 ul DNA (10% het totale volume) per reaction kan mogelijk onzuiverheden in de DNA-monsters remmen PCR reacties.

6. PCR Fietsen

1. Voer PCR amplificaties in een thermocycler uitgerust met een verwarmd deksel met behulp van de volgende PCR-fietsen parameters. We gebruiken de Mastercycle pro S thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) ingesteld om te werken met standaard temperatuur aanloop omstandigheden. Elke kwaliteit thermocycler moet goed te presteren.
   

   Cyclus	Denaturatie Gloeien	Polymerisatie
   1	2 min bij 95 ° C
   2	30 sec bij 95 ° C	30 sec bij 61 ° C 90 sec bij 68 ° C 35 cycli
   3		5 min bij 68 ° C
   Houden op 4 ° C tot het monster wordt verwijderd

2. Optimaliseren voorwaarden voor PCR (inclusief primer hybridisatietemperatuur verlengingstijden, en het aantal cycli) nodig afhankelijk van de kwaliteit van het DNA primers Taq-polymerase of type thermocycler gebruikt. Aanbevolen om een gradiënt kan thermocycler het bepalen van de optimale gloeien temperaturen.
3. Indien de thermocycler gebruikte niet verwarmd deksel voeg 1 druppel minerale olie de top van elk monster om verdamping gedurende PCR fietsen.

7. Gelelektroforese van PCR producten

Om de resultaten van de analyse visualiseren afzonderlijke PCR producten op een 1% agarosegel volgens standaardprocedures elektroforese.

1. Combineer 2 pi van een standaard DNA laadbuffer (typisch 5x of 6 oplossing) met 5 pi van elk PCR-product geamplificeerd.
2. Plaats monster op een 1% agarose gel met EtBr (ethidiumbromide kleuring voor DNA) gemaakt either TAE of SB (natriumboraat) buffersystemen ^16. We gebruiken 1 pi van een 10 mg / ml voorraadoplossing EtBr per 100 ml 1% agarose (0,1 ug / ml).
3. Run monsters op ~ 120V tot de kleurstof voorkant bereikt ¾ van de totale lengte van de gel.
4. Onder UV-licht (bijvoorbeeld een korte golf UV-licht doos), inspecteren de resulterende bands om te zien of een geschikt fragment was geamplificeerd.
5. Documenteer de gel en de daaruit voortvloeiende banden met behulp van een beschikbare foto-documentatie van systeem of camera.

8. Representatieve resultaten

Bij weergave van de PCR-producten, cogongrass een uniek strepen patroon ten opzichte van JBG of teruggezet JBG (figuur 5). Voor elk DNA-monster, moet de trnL-F positieve controle primerset resulteren in een hoge intensiteit band op ~ 890 bp. Dit wordt gecontroleerd of alle PCR-reagentia goed werken. Ook moet de negatieve controle (geen template) reactie bevatten geen banden voor een primer set gebruikt. Dit bevestigt dat geen van de reagentia werden besmet.

Als het DNA monster afgeleid van wild-type cogongrass een PCR reactie met de cogongrass specifieke primerset resulteert in een band ~ 595 bp wanneer de JBG-specifieke primers, waardoor er geen band. Ook indien het DNA monster uit JBG of teruggekeerd JBG, een PCR reactie met de JBG specifieke primerset resulteren in een band ~ 594 bp wanneer de cogongrass-specifieke primers, waardoor er geen band. Omdat JBG en keerde JBG identieke nucleïnezuursequentie, zullen zij derhalve een identieke bandenpatronen. Als er veel monsters worden vergeleken een gel tegelijkertijd, raden lopen alle monsters afkomstig van elke primer naast elkaar zetten, waardoor het beter de monsters positieve resultaten scannen.

Morfologische verschillen tussen JBG en JBG terug zijn vrij duidelijk (bijv. rode kleur van de bladeren en kleinere gestalte van JB G ten opzichte van de groene kleur, grotere gestalte en agressieve groei van het JBG terug), dus terwijl de PCR-resultaten zal hetzelfde zijn, de JBG rassen zijn gemakkelijk te onderscheiden met behulp van planten morfologie.

Figuur 1. Vergelijking van de kas geteelde Imperata cylindrica var. Koenigii (Japans bloed gras), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Ongedaan maken) en I. cylindrica (wild-type cogongrass).

Figuur 2. Een voorbeeld van DNA monsters gecontroleerd met een NanoDrop spectrofotometer. Merk op dat, ongeacht de gebruikte spectrofotometer, de 260/280 verhouding moet in de buurt van 1.8 en de 260/230 verhouding moet in de buurt van 2.0.

NHOUD ">
Figuur 3. DNA gecontroleerd met behulp van standaard gel elektroforese op een 1% agarose gel. Een commerciële DNA-merker werd gebruikt voor de grootte analyse. Lane 4 is een voorbeeld van slechte kwaliteit DNA monster met versmerings-en sommige RNA verontreiniging.

Figuur 4. Volgorde uitlijningen van de trnL-F regio's van Imperata cylindrica var. Koenigii (Japans bloed gras), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Ongedaan maken) en I. cylindrica (wild-type cogongrass). Verticale zwarte pijlen geven de verschillen in sequenties als gevolg van SNPs en indels. Horizontale groene pijlen geven de posities van de Wild-type cogongrass primers gebruikt voor cogongrass-specifieke PCR. Horizontale rode pijlen geven de positions van de JBG en JBG Terugkeren primers gebruikt voor JBG-specifieke PCR.

Figuur 5. Representatief resultaat van gelelektroforese van PCR-producten afgeleid van cogongrass, JBG en JBG terug DNA gecombineerd met cogongrass en JBG-specifieke primers en de trnL-F positieve controle en geen template negatieve controle.

Discussie

De Amerikaanse kleuter-en het landschap industrie baseert zich op het kweken en verkopen van exotische en nieuwe plantensoorten. Dit, in combinatie met de toenemende globalisering van de handel, verhoogt de kans dat een invasieve plantensoorten zullen voeren, vast te stellen en te verspreiden in de VS De mogelijkheid om de federale regels voor dergelijke planten is gebaseerd op informatie die vaak niet beschikbaar is, inclusief de mogelijkheid om invasief te worden , de juiste taxonomie, en genetische eigenheid uit autochtone en genaturaliseerde taxa. Door onze kennis van invasieve planten is vaak beperkt, zijn geïmporteerde planten met verborgen invasieve eigenschappen zijn vrijwillig opgenomen om later te leren dat ze onze landbouw en natuurlijke hulpbronnen binnen te vallen. Dit protocol is gericht aan te pakken die problemen in verband met I. cylindrica rassen door het verstrekken van de eerste vereenvoudigde moleculaire methode die nauwkeurig kan onderscheid maken tussen wild-type cogongrass en keerde vorm van zijn decoratieve JBG tegenhanger.

jove_content "> Voor de ontwikkeling van dit protocol, werd wild-type cogongrass verzameld uit genaturaliseerde populaties op het Pond Creek Bosbouw-eenheid in Santa Rosa County in de buurt van Jay, FL in juni van 2008. JBG werd aangekocht bij een commerciële kwekerij (Bluebird Nursery, Inc ..) in juni 2008 en van een huis de collectie in Columbia JBG terug werden verkregen van de binnenplaats van de Campbell Geologisch Museum in Clemson University, SC in juni 2008, van University Park in Riverdale, MA in juni 2009, en uit de voortuin van een huis in Columbia in 2009 (geïdentificeerd door Leland Cseke). Alle planten werden aangehouden in een kas gelegen aan de Universiteit van Alabama in Huntsville (Huntsville, AL).

Genetische sequentie van DNA afkomstig van deze planten onder de diepte vergelijkingen 9 onafhankelijke DNA's die worden gebruikt om barcode planten ^2. In alle gevallen de volgorde van JBG was 100% overeenkomst met die van de JBG terug en daardoor aanverifiëren dat JBG inderdaad terug te keren naar een groene, invasieve vorm. Alleen de nucleaire ITS en de chloroplast trnL-F's hebben verschillen die kunnen worden gebruikt om genetisch onderscheid te maken tussen cogongrass en JBG. De ITS-regio heeft in totaal 3 SNPs (single nucleotide polymorfismen) tussen cogongrass en JBG, terwijl de trnL-F regio heeft 2 SNP's en 2 indels (inserties en deleties). Deze genetische verschillen toegestaan ​​verscheidenheid-specifieke PCR-primers te ontwikkelen die onderscheid kan maken tussen wild-type cogongrass en JBG terug. De meest betrouwbare resultaten uit primers afgeleid van de plastide trnL-F gebied. Aldus wordt dit protocol gebaseerd op de sequentie verschillen tussen de trnL-F gebieden van de chloroplastgenoom van cogongrass, JBG en teruggekeerd JBG (figuur 4).

Om u te helpen het genereren van primers die meer specifiek zijn voor de rassen in kwestie en om te helpen voorkomen dat valse meldingen van nauw verwante soorten, all bekende trnL-F sequenties I. cylindrica rassen werden vergeleken met trnL-F sequenties uit verwante grassoort (43 onafhankelijke sequenties uit 29 soorten, bijvoorbeeld Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix Lacryma-Jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorghum halepense). Hoewel we verschillende-specifieke primer sequenties onderzocht in 29 soorten gras, de specificiteit van het ras-specifieke primers is niet uitgebreid onderzocht op zijn vermogen om DNA te amplificeren van de meeste andere grassoorten. Bijgevolg moeten weefsel gebruikt voor DNA-extractie zorgvuldig worden geïdentificeerd I. cylindrica vóór het begin van dit protocol. Als het gras niet kan worden onderkend dat zij cogongrass of JBG, dan raden wij sequencing van het PCR-product om ervoor te zorgen dat de sequenties zijn een exacte overeenkomst aan cogongrass of JBG. Momenteel is de nauwkeurige methode om de identiteit van een bepaald monster gras te controleren is PCR op zowel de tRNL-F en ITS-gebieden, gevolgd door sequentie controle van PCR producten en vergelijking van de sequenties bekende sequenties niet nauwkeurig vastgestelde taxa. DNA kan worden versterkt met behulp van controle primers beschreven in dit protocol (voor de trnL-F regio) of andere primers die beschikbaar zijn in andere publicaties ^13-15. Sequencing is veel meer arbeid en kosten intensief dan het gebruik van onze vereenvoudigde procedure.

De kwaliteit van de primers gebruikt voor PCR is voor het succes van de behandeling. We hebben de primers voor deze procedure beschikbaar zijn vanaf Oblique Bio, Inc ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Het voordeel bestelling van de primers uit schuine Bio is dat grote aantallen monsters van elke primer van de identieke monsters productieseries de primers we voor optimalisatie in ons laboratorium slaan. Derhalve primers niet alleen dezelfde volgorde, maar they komen uit exact dezelfde productie veel dat werd gebruikt in dit protocol. Met behulp van primers van dezelfde partij, kan helpen voorkomen dat externe variabelen in de procedure die kan voortvloeien uit verschillen in de kwaliteit van de PCR-primers. Evenzo zal terwijl andere Taq polymerase moeten werken voor PCR werd de kwaliteit van de gebruikte Taq polymerase van invloed op de kwaliteit van PCR resultaten. Om ervoor te zorgen voor een betere consistentie in PCR-reagentia, hebben we het protocol geoptimaliseerd met behulp van reagentia van Clontech. De Voordeel 2 Polymerase (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 of 639202) is een mengsel van een robuuste, hot-start Taq-polymerase en een proof-lezen enzym dat helpt om een ​​hoge specificiteit en nauwkeuriger amplificaties.

Omdat dit protocol is gebaseerd op chloroplast DNA, dat de moeder wordt geërfd in grassen, kan hybridisatie tussen cogongrass en JBG genotypes niet te vangen met onze moleculaire identificatie procedure. In gevallen waarin hypridization is suspected, raden we u aan nucleaire regio's die zijn overgenomen van beide ouders. De meest gebruikte niet-plastide variabele gebied om te overwegen in plantaardige genotypering is de nucleaire ribosomale ITS gebied ^13-15,17. Op dit moment maken we vooruitgang in de richting multiplexing de versterking van de chloroplast trnL-F regio met die van de nucleaire ITS regio in dezelfde PCR-buis. Multiplexing plastide met nucleaire DNA-regio's zou mogelijk omzeilen van de beperkingen van het gebruik, hetzij alleen, maar dergelijke methoden vereisen optimalisatie en bijkomende evaluatie om de haalbaarheid te bepalen van geval tot geval. Het gebruik van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) en nieuwere technologieën, zoals moleculaire beacons (fluorescerende probes primer), worden ook beoordeeld als fail-safe en nauwkeurige plant genotypering methoden.

Het protocol hier gepresenteerde biedt een snelle en betrouwbare aanpak te onderscheiden van de JBG terug van dat van wild-type cogongrass. Wij moedigen het gebruikrs van dit protocol om ons te contacteren om de resultaten verkregen uit het gebruik van dit protocol te melden. Die gedeelde informatie zal helpen informatie te verstrekken over de verdeling van JBG terug. Dit zal ook helpen regelgevers op het USDA weloverwogen beslissingen nemen over de maatregelen die kunnen worden nodig om de verspreiding en de mogelijke hybridisatie van de zeer invasieve soorten cogongrass te omzeilen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen, Valencia, CA	69104 of 69106	Elke gerenommeerde genomische plant DNA kit die goede kwaliteit levert DNA zou moeten werken voor deze procedures.
trnF (GAA)-F	Oblique Bio, Inc	3-0578	Forward positieve controle primer
trnL (5 'exon)-C	Oblique Bio, Inc	3-0579	Reverse positieve controle primer
trnLF-C-F1	Oblique Bio, Inc	3-0864	Forward wild-type cogongrass primer
trnLF-C-R1	Oblique Bio, Inc	3-0865	Omkerenwild-type cogongrass primer
trnLF-R-F2	Oblique Bio, Inc	3-0866	Forward JBG en JBG terug primer
trnLF-R-R2	Oblique Bio, Inc	3-0867	Reverse JBG en JBG terug primer
Voordeel UltraPure PCR dNTP Mix	Clontech, Mountain View, CA	639125
Voordeel 2 Polymerase	Clontech, Mountain View, CA	639201 of 639202	Een goede proeflezen, hot-start Taq-polymerase