Imaging Feromoon Sensing in een muis Vomeronasal Acute Tissue Slice Voorbereiding

Samenvatting

Bij muizen, is de mogelijkheid om feromonen te detecteren hoofdzakelijk gemedieerd door de vomeronasale orgaan (VNO). Hier is een acute weefsel stuk voorbereiding van VNO voor het uitvoeren van calcium beeldvorming beschreven. Deze fysiologische aanpak maakt het mogelijk waarnemingen van subpopulaties en / of individuele neuronen in een levend weefsel en is handig voor het receptor-ligand identificatie.

Samenvatting

Peter Karlson en Martin Lüscher gebruikte de term feromoon voor de eerste keer in 1959 ¹ tot en met chemicaliën die worden gebruikt voor het binnen dezelfde soort communicatie te beschrijven. Feromonen zijn vluchtige of niet-vluchtige korte duur moleculen ^twee afgescheiden en / of in biologische vloeistoffen ^3,4, zoals urine, een vloeistof waarvan bekend is dat een belangrijke bron van feromonen ^3. Pheromonal communicatie is betrokken bij een groot aantal belangrijke dierlijke modaliteiten zoals verwanten interacties ^5,6, hiërarchische organisaties ³ en seksuele interacties ^7,8 en zijn dus direct gecorreleerd met de overleving van een bepaalde soort ^9,10,11. Bij muizen, is de mogelijkheid om feromonen te detecteren hoofdzakelijk gemedieerd door de vomeronasale orgaan (VNO) ^10,12, een gepaarde structuur gelegen aan de voet van de neusholte, en opgesloten in een capsule kraakbeen. Elke VNO heeft een buisvormige vorm met een lumen ^13,14 waardoor het contact met de externechemische wereld. De sensorische neuroepithelium bestaat voornamelijk uit vomeronasal bipolaire sensorische neuronen (VSNs) ^15. Elke VSN strekt zich een enkele dendrieten naar het lumen eindigend in een grote knop met dendritische tot 100 microvilli betrokken bij chemische detectie ^16. Talrijke subpopulaties van VSNs aanwezig zijn. Ze worden onderscheiden door de chemoreceptor ze uitdrukken en dus eventueel door de ligand (s) ze herkennen ^17,18. Twee belangrijke vomeronasal receptor families, V1Rs en V2Rs ^19,20,21,22, worden respectievelijk samengesteld door 240 ²³ en 120 ²⁴ leden en worden uitgedrukt in afzonderlijke lagen van de neuroepithelium. Olfactorische receptoren (OR's) ²⁵ en formyl peptide receptoren (FPRs) ^26,27 worden ook uitgedrukt in VSNs.

Of deze neuronale subpopulaties gebruik van dezelfde downstream-signaleringsroute voor het waarnemen van feromonen is onbekend. Ondanks een grote rol gespeeld door een calcium-permeabel kanaal (TRPC2) aanwezig in de microvilli van de volwassen neuronen ²⁸ TRPC2 onafhankelijke transductie kanalen zijn voorgesteld ^6,29. Vanwege het hoge aantal van neuronale subpopulaties en de eigenaardige morfologie van het orgel, farmacologische en fysiologische onderzoeken van de signalering elementen aanwezig zijn in het VNO zijn complex.

Hier presenteren we een acute weefsel plak de voorbereiding van de muis VNO voor het uitvoeren van calcium imaging onderzoek. Deze fysiologische aanpak maakt het mogelijk waarnemingen, in de natuurlijke omgeving van een levend weefsel, van algemene of individuele subpopulaties van VSNs eerder geladen met Fura-2AM, een calcium kleurstof. Deze methode is ook geschikt voor het bestuderen van een GFP-gelabelde feromoon receptor en is aanpasbaar voor het gebruik van andere fluorescerende probes calcium. Als voorbeeld gebruiken we hier een VG muis lijn ^30, waarbij de vertaling van het feromoon V1rb2 receptor is om de expressie van GFP met elkaar verbonden door een polycistronisch strategie.

Protocol

1. Dissectie van de muis VNO

1. Gebruik volwassen muizen. Als feromoon sensing is betrokken bij multimodalities, zorgvuldig onderscheid tussen de stammen, genotypen, geslachten en leeftijden is belangrijk en zal invloed hebben op uw resultaten. Hier kiezen we ervoor volwassen muizen VG ³⁰ eerder gebruikt voor de identificatie van een feromoon-receptor paar (2-heptanon-V1rb2) ³¹ (Fig. 1A).
2. Voordat u begint met het ontleden, bereiden vers koud kunstmatige cerebro-spinale vloeistof (ACSF, NaCl 118 mM, NaHCO ₃ 25 mM, D-Glucose 10 mM, KCl 2 mM, _MgCl2 2 mM, NaH ₂ PO ₄ 1,2 mM, CaCl _{2 2} mM, pH 7,4) verzadigd met oxycarbon (95% O _2: 5% CO _2). Voor dat, mix alle ACSF componenten behalve CaCl _2. Verzadig de oplossing door rechtstreeks borrelen met oxycarbon. Op het einde, voeg de CaCl ₂ en aan te passen met DDH ₂ 0 tot het gewenste volume. Houd de ACSF oplossing op ijs totdat use.
3. Euthanasie van de muis moet bij voorkeur worden uitgevoerd door cervicale dislocatie of door CO ₂ inhalatie net voor het experiment.
4. Snij de muis hoofd. Plaats het weer onder een dissectie microscoop in koud ACSF continu oxycarbonated.
5. Snijd de onderkaak en de positie van het hoofd om het gehemelte (Fig. 1B) te visualiseren.
6. Horizontaal Maak een insnijding in het bovenste deel van het gehemelte (Fig. 1B) met micro schaar en verwijder het gehemelte membraan met micro ontleden tang. Hydrateren en het reinigen van de bloot holte met ACSF (Fig. 1C).
7. Snij de bovenste en het onderste deel van het neustussenschot (afb. 1C). Fijn extract het neustussenschot met het VNO en direct plaats deze in ACSF op ijs (fig. 1D).
8. Afzonderlijke verticaal de twee delen van de VNO met behulp van micro ontleden pincet en verwijder voorzichtig de kraakbenige capsule van de VNO (Fig. 1E). Zorg ervoor dat alle kraakbeenvissen stukken zijn verwijderd.

2. VNO weefsel slice voorbereiding

De VNO weefsels slice voorbereiding beschreven in deze sectie 2) is voornamelijk voor de calcium imaging onderzoek. VNO plakjes kan ook gebruikt worden voor immunohistostainings op drijvende plakken om de structurele integriteit van het weefsel (zie hoofdstuk 3) van het protocol) te controleren.

1. Bereid laagsmeltende agar (3% in standaard PBS) en uw werkplek. U moet ACSF, een microtoom en ondersteunt, micro ontleden tang, inbedding mallen (22 x 22 x 20 mm), precisie doekjes, borstels, weefselkweek platen, cyanacrylat lijm, ijs en een thermometer.
2. Vul de inbedding mal met 3% laag-smeltende agar. Zorg ervoor dat de temperatuur niet hoger is dan 41 ° C voordat het verticaal vlak geveegd VNO (Fig. 2A) om te kunnen coronale slices te verkrijgen.
3. Plaats de inbedding schimmel op ijsgedurende 1 min tot stollen en vervolgens scheiden van de agar te blokkeren. Snijd de agar blok in een piramidale vorm en plaats deze met lijm op de microtoom ondersteuning (Fig. 2B).
4. Snijd coronale VNO plakjes met de microtoom, met een snelheid van 0,5 mm / s, een amplitude van 0,7 mm en een dikte van 100 in koude ACSF en het verzamelen van het weefsel plakjes met een borstel voordat u ze in een weefselkweek bord gevuld met koud ACSF.
5. Als je schijfjes bevatten endogene fluorescentie, zoals GFP (in gen-gerichte neuronen) kunt u ze onder een tl-stereomicroscoop (Fig. 2C).

3. Immunohistochemie op VNO zwevende schijven

Het doel van deze procedure is om te controleren of de integriteit van de VNO weefsel plakjes verkregen in paragraaf 2). Geacetyleerde-tubuline is een microtubule / cytoskelet marker, uitgedrukt in dendrieten en microvilli van VNO sensorische neuronen. Voor calcium imaging experimenten, ga dan richtingtgevoerd naar paragraaf 4) van het protocol. De immunohistostaining methode op drijvende VNO plakjes kan worden aangepast aan de evaluatie van de expressie van een eiwit van belang. Voor dit doel, raden wij u aan de VNO oplossing voor 1 uur bij 4 ° C in een fixeermiddel oplossing (paraformaldehyde 4% in PBS, pH 7,6) na de punt 1.7) van het protocol en het gebruik van dit punt PBS bij pH 7,6 in plaats van ACSF oplossing.

1. In de weefselkweek plaat, fix je plakjes van interesse in een fixeermiddel oplossing (paraformaldehyde 4% in PBS, pH 7,6) 1 uur bij 4 ° C.
2. Blokkeer je weefsel plakjes overnacht bij 4 ° C in een PBS-oplossing die NGS (normaal geit serum) 10% en de triton X-100 op 0,5%.
3. Incubeer plakjes met het primaire antilichaam (anti-geacetyleerd tubuline-, Muis, 1:2000) voor 16h bij kamertemperatuur (RT) in een PBS-oplossing met NGS 5% en Triton X-100 op 0,25%.
4. Was drie keer voor 5 minuten met een PBS oplossing die NGS 2%.
5. Incubeer in het donker met de secondary antilichaam (Cy5-geconjugeerd geit anti-muis, 1:200) in een PBS-oplossing die NGS 2% voor 1 uur bij RT.
6. Was drie keer voor 5 minuten met PBS dat NGS 2%, PBS NGS 1% en PBS alleen.
7. Bevestig uw plakjes in een fluorescerende montage media (met al dan niet DAPI) door ze te plaatsen in het midden van het hydrofobe afgebakende zones (gebruik een hydrofoob pen) en bedek de plakjes met dekglaasjes.
8. Maak observaties en acquisities met confocale microscopie en een software waarmee 3D-reconstructies (fig. 2D-F).

4. Calcium beeldvorming over VNO plakjes

1. De volgende procedures zal plaatsvinden in het donker. Incubeer VNO plakken voor 1 uur bij 37 ° C in een laad-oplossing bestaande uit koude ACSF met Fura-2AM (7 micrometer, stockoplossing van 1 mM in DMSO) en Pluronic 0,1% (w / v; voorraad-oplossing bij 20% in DDH ₂ O).
2. Houd de geladen plakjes op ijs met oxycarbonation tot gebruik. Geladen plakjes kunnen worden bewaard voor3-4h.
3. Leg de plakjes geladen met een borstel in een perfusie kamer met ACSF en onderhouden van de plakjes met een tissue slice anker (Fig. 3A).
4. Plaats de perfusie kamer op het podium van een calcium-imaging microscoop (Fig. 3B) en de continu met oxycarbonated ACSF perfuseren bij RT. Temperatuur kan worden aangepast met het gebruik van een bipolaire temperatuurregelaar.
5. Waarnemingen van de geladen VNO plakjes (fig. 3C-E) worden uitgevoerd met een omgekeerde fluorescentie microscoop, met een 25x of 63x objectief en een CooL SNAP-HQ camera. Verlichting wordt in volgorde gedaan (340/380 nm) met een polychromator instrument en opgenomen met een snelheid van 5 Hz. Gefilterde emissie wordt gedaan bij 510 nm. Intracellulair calcium-verhouding verandert (AF = 340 nm/380 nm) worden gecontroleerd met een geschikte software.
6. Chemostimulation moeten worden geselecteerd op basis van uw eigen experimentele doeleinden. Hier perfusie van ACSF met een feromoon mix (isobutylamine, 2-heptanon, 4-heptanon, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farneseen, 10 ^-6 M), 2-heptanon (10 ^-6 M) of vers verzameld man en vrouw (1: 1) muis urine (1:100) worden uitgevoerd ^32. Perfusie van ATP (125 uM) wordt gebruikt als een levensvatbaarheid test aan het einde van de experimenten (fig. 3F) en moet een deel van ongeveer 80% levensvatbare neuronen te geven. Onder deze omstandigheden kan schijfjes gebruikt worden tot 2 uur.
7. GFP-gelabelde subpopulaties van sensorische neuronen worden gevisualiseerd door specifieke verlichting (hier de V1rb2 uiten neuronen) en kan nauwkeurig worden geanalyseerd (fig. 3G-I).

5. Representatieve resultaten:

Naar een functionele test vast te stellen van de multi transductie paden die plaatsvinden in het VNO muis, of om nieuwe feromoon-receptor paren te identificeren onderzoeken, we profiteren van de VG muis lijn (Fig. 1A ). In deze lijn, een op de 240 V1Rs receptoren, de V1Rb2 receptor is GFP-gelabelde waardoor de eenvoudige visualisatie van een bepaalde subpopulatie van vomeronasal sensorische neuronen. Na extractie en dissectie van het VNO (fig. 1E), bereiden we acute VNO plakjes (fig. 2C). We hebben vast een fractie van hen, om te controleren en de tissular integriteit van de voorbereiding te valideren door het uitvoeren van immunohistostainings tegen de geacetyleerde-tubuline eiwit (fig. 2D-F). De andere fractie van de schijfjes wordt gebruikt voor het calcium imaging experimenten. Daarvoor zijn schijfjes vol met Fura-2AM (fig. 3C-E) en de intracellulaire calciumconcentratie niveau van elk neuron wordt bewaakt als een AF-ratio (fig. 3F). Levensvatbaarheid van de neuronen wordt geëvalueerd door perfusie van ATP (125 uM), waarna een snelle en tijdelijke verhoging van de AF-ratio wordt verwacht (Fig. 3F). Urine als een belangrijke bron van feromonen, perfusie van versely verzameld muis urine (1:100) wordt gebruikt als een endogene controle. Het triggers calcium transiënten in ongeveer 50% van de geregistreerde neuronen (cel 1 en 2, Fig. 3F). Onder GFP verlichting, zijn V1Rb2 positieve neuronen waarneembaar, en perfusie van de bekende pheromonal ligand, 2-heptanon, initieert cellulaire activering (cel 1, Fig. 3I). Interessant is dat neuronale activeringen ook waarneembaar in een fractie van neuronen die niet uiten de V1Rb2 receptor (GFP negatief neuronen) (cel 2, Fig. 3I), hetgeen de complexiteit van de feromonen codering in de VNO.

Figuur 1. Dissectie van de muis vomeronasale orgaan. (A) Een muis uit het VG lijn. (B) Na euthanasie van de muis, is het volledige hoofd onder een binoculaire microscoop en de onderkaak is verwijderd om het gehemelte te visualiseren. Een kleine horizontale incisie wordt gedaan(Zwarte stippellijn). (C) Na het verwijderen van het gehemelte, is het neustussenschot bekleed met het VNO gesneden in de bovenste en het onderste deel (wit gestippelde lijnen) naar VNO extractie te vergemakkelijken. (D) De VNO is gepositioneerd in ACSF oplossing en gescheiden (invoegen: hogere macht uitzicht op de twee delen). (E) De kraakbeenachtige capsule van de VNO is delicaat verwijderd en de VNO zonder zijn kraakbeenvissen capsule wordt gebruikt voor de rest van de experimenten. Schaal bars zijn: BE, 1 mm.

Figuur 2. Muis vomeronasal acute slice voorbereiding en tissular integriteit. (A) De muis VNO is verticaal ingebed in een agar 3% oplossing. De temperatuur van de agar moet lager zijn dan 41 ° C. (B) De agar blok wordt gesneden in een piramidale vorm en 100 um VNO secties (zwarte stippellijn) worden gegenereerd in ACSF. (C) VNO plakjes kunnen worden geselecteerd onder een tl-stereomicroscoop in om een ​​specifieke visualiserenbevolking van getagd sensorische neuronen. (DF) Tissular integriteit kan worden geëvalueerd door immunohistostainings tegen de geacetyleerde-tubuline eiwit, een hogere macht uitzicht op de V1rb2 gen-gerichte neuronen tonen de perfecte behoud van het preparaat. Neuronen met hun lange dendrieten bereiken van de oppervlakte van het lumen (E) en als de uitdrukking van de structurele eiwit in de dendritische knoppen en microvilli kan worden waargenomen (F). Schaal bars zijn: B, 5 mm, C, 60 micrometer, D, 40 micrometer, EF, 20 um.

Figuur 3. Calcium beeldvorming en feromoon detectie in vomeronasal acute weefsel plakjes. (A) Na een Fura-2AM laden fase worden VNO plakjes geplaatst in een perfusie kamer en worden onderhouden met een aangepaste anker (high power te bekijken). (B) experimenten worden uitgevoerd in het donker en VNO plakjes worden voortdurend geperfuseerd met ACSF bij RT met een vacuümsysteem. De temperatuur kan worden chosen met behulp van een temperatuurregelaar systeem bestaat uit een bipolaire Pelletier element en een thermische sonde. Deze bijzondere experiment werd uitgevoerd bij kamertemperatuur. (CE) VNO schijfjes zijn waarneembaar onder Hoffman phase contrast (C, Hv) of Fura 380 nm verlichting voor (D) en tijdens neuronale activering (E, hier met ATP). (F) Neuronale leefbaarheid is geëvalueerd met perfusie van ATP (125 uM). Hier wordt chemostimulation gedaan met urine (urine, 1:100) of met een mix van muizen feromonen (mix ph., 10 ^-6 M) op een constant debiet van 165 ml / uur Intracellulaire calciumgehalte (AF) kan afzonderlijk worden opgenomen voor elke cel (Cell 1 tot 3). (G) Een V1Rb2 neuron wordt gevisualiseerd onder GFP verlichting (1). (H) Het laden van deze neuron (1), evenals een niet-V1rb2 uiten neuron (2) is getoond. (I) De V1rb2 neuron is in staat om tot 2-heptanon reageren met een intracellulair calcium te verhogen. Deze specifieke niet-V1rb2 uiten neuron speelt ook in op 2-heptanon (cel 2). Schaal bars zijn: CE, 20 micrometer, GH,15 micrometer; AF = 340 nm / 380 nm. (F en I) Duur van de stimulus applicatie is aangegeven door balken onder elke spoor. De willekeurige kleur schaal staat voor de fluorescentie-intensiteit.

Discussie

De calcium-imaging methode hier voorgesteld in staat stelt om, op te nemen in een acute slice voorbereiding, de pheromonal reacties van de muis VNO neuronen. Met deze aanpak, dissectie van het dier naar de vomeronasale neuronen is, met enige oefening, gemakkelijk bereikbaar en biedt een lange-levend weefsel voorbereiding. Het maakt tijdrovende experimenten zoals farmacologische onderzoek of de studie van pheromonal codering. Met deze fysiologische techniek kunnen grote populaties, alsmede nauwkeurige neuronale subpopulaties bijzonder aandacht worden besteed. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden aangepast aan immunohistochemische benaderingen of experimenten gebaseerd op andere calcium-kleurstoffen. Het gebruik van deze gecombineerde methodieken zal zeker de identificatie van nieuwe pheromonal liganden voor de vele wees chemoreceptoren, uitgedrukt in de muis vomeronasale orgaan.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Adenosine 5'-trifosfaat dinatriumzout oplossing (ATP)	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO
Agar-agar	Sigma-Aldrich	A7002-100G	Voorkeur voor immunohistochemie
Agar (laag-smeltende)	Sigma-Aldrich	A0701-25G	Voorkeur voor calcium imaging
CL-100 Bipolaire temperatuurregelaar	Warner Instruments	W64-0352
Confocale microscoop	Leica Microsystems	SP5 AOBS
Cy5-AffiniPure geit anti-muis IgG	Jackson ImmunoResearch	115-175-071	Beschermen tegen licht
DMSO (dimethylsulfoxide)	Merck	317275-100ML
Inbedding mallen, Peel-A-Way	Polysciences	18646A-1	22 x 22 x 20 mm
TL-montage media (Vectashield met DAPI, 10 ml)	Rectolab	H-1200
Fura-2AM	Teflabs	0103	Beschermen tegen licht
Glisseal N (vacuüm vet, 60 g)	Borer Chemie	Glisseal N
Groot bad opname kamer (RC-26G)	Warner Instruments	64-0235
MetaFluor (software voor calcium beeldvorming; v.7.6.5.0)	Visitron Systems
Monoklonale anti-tubuline, acetylerend muis antilichaam	Sigma-Aldrich	T6793-.2ML
Normaal geit serum (NGS, 10 ml)	Interchim	UP379030
Platform voor kamers (P-1)	Warner Instruments	64-0277
Pluronic F-127, 2 g	Invitrogen	P-6867
Roti Coll (Doseren fles, 10 g)	Carl Roth	0258.1
SC-20 Dual In-line oplossing heater / Cooler	Warner Instruments	W64-0353
Slice anker (SHD-26GKIT)	Warner Instruments	64-0266
Stereofluorescence microscoop	Leica Microsystems	MZ16FA
Super PAP PEN (hydrofobepen)	Pelco International	22309
Triton X-100	Fluka	93420-250ML
Vibrerende mes microtoom VT 1200S	Leica Microsystems	14048142066
VisiChrome hoge snelheid polychromator systeem	Visitron Systems
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1)	Bitplane Scientific Software