Een Contusive model van eenzijdige cervicale ruggenmerg letsel met behulp van de Oneindige Horizon Impactor

Samenvatting

Een betrouwbare en herhaalbare manier om een ​​eenzijdige cervicale dwarslaesie het gebruik van de oneindige horizon botslichaam te produceren wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen frame en vast te klemmen aan de wervelkolom te stabiliseren. De gestandaardiseerde procedure en biomechanische letsel parameters resulteren in een toereikende en duurzame verwondingen.

Samenvatting

Terwijl de meerderheid van de menselijke ruggenmerg letsels ontstaan ​​in de cervicale ruggenmerg, de overgrote meerderheid van laboratorium-onderzoek maakt gebruik van dierlijke modellen van dwarslaesie (SCI), waarin de thoracale ruggenmerg is geblesseerd. Bovendien, omdat de meeste menselijke snoer letsels ontstaan ​​als gevolg van botte, niet-penetrerende trauma (bijv. auto-ongevallen, sportieve letsel), waar het ruggenmerg met geweld wordt getroffen door de verplaatste bot of weke delen, de meerderheid van de SCI onderzoekers zijn van mening dat de klinisch meest relevante schade-modellen zijn die waarin het ruggenmerg snel gekneusd. ¹ Daarom, een belangrijke stap in de preklinische evaluatie van nieuwe behandelingen op hun weg naar menselijke vertaling is een beoordeling van hun doeltreffendheid in een model van contusie SCI binnen het cervicale ruggenmerg. Hier beschrijven we de technische aspecten en de daaruit voortvloeiende anatomische en gedragsmatige gevolgen van een eenzijdige contusive model van cervicale dwarslaesie dat het werkInfinite Horizon dwarslaesie botslichaam.

Sprague Dawley ratten ondergingen een linkszijdige eenzijdig laminectomie op C5. Om de reproduceerbaarheid van de biomechanische, functionele en histologische resultaten van het letsel model te optimaliseren, hebben we gekneusd het ruggenmerg met behulp van een slagkracht van 150 kdyn, een impact traject van 22,5 ° (dieren gedraaid bij 22,5 °), en een impact locatie niet ver van van de middellijn van 1,4 mm. Functioneel herstel werd gemeten met de cilinder opvoeding test, horizontale ladder test, verzorging test en gewijzigd Montoya's Staircase-test voor maximaal 6 weken, waarna het ruggenmerg werden histologisch geëvalueerd voor witte en grijze stof sparende.

De blessure hier gepresenteerde model verleent consistente en reproduceerbare biomechanische krachten aan het ruggenmerg, een belangrijk kenmerk van een experimentele SCI model. Dit resulteert in discrete histologische schade aan de laterale helft van het ruggenmerg die grotendeels bevat thij ipsilaterale kant van letsel. De blessure wordt goed verdragen door de dieren, maar resulteert in functionele tekorten van de voorpoot die van belang zijn en in stand in de weken na letsel. De cervicale eenzijdige letsel hier gepresenteerde model kan een bron voor onderzoekers die willen veelbelovende therapieën te evalueren voorafgaand aan menselijke vertaling te zijn.

Protocol

1. Stel: Frame en klem Design for Vasthouden van de Animal

1. Het frame en klem om het dier te houden was speciaal ontworpen om de Oneindige Horizon (IH) ruggenmergletsel Impactor tegemoet te komen.
2. De basis van het frame is een aluminium platform gesneden in de volgende afmetingen (30,2 cm x 20,3 cm x 1,3 cm) om te passen in de tabel gids beugel die wordt standaard geleverd met de IH-apparaat (figuur 1a).
3. Vier Flexaframe ondersteuning voetplaten (Fisher Scientific, Toronto, ON) zijn bevestigd aan het platform en acht Flexaframe ondersteuning staven (Fisher Scientific, Toronto, ON, 30,5 cm) worden geassembleerd met behulp van acht Flexaframe ondersteuning connectoren (Figuur 1B).
4. Twee extra Flexaframe ondersteuning connectors, toegevoegd aan de middelste twee stangen, huis gemaakt de aangepaste geldt voor de klem (Figuur 1B).
5. De hoek waaronder het dier ruggenmerg gedraaid ten opzichte van verticaal wordt bepaald door keeping een van de horizontale stang plaats en variëren van de hoogte van de andere horizontale stang (figuur 2).
6. De klem 35.6 mm, +25,4 mm hoog en 7,6 mm kaak ter vast te grijpen onder de transversale vlak houdt van C4-C6 (figuur 1c). Meer details over de klem ontwerp zijn eerder beschreven door Choo et al.. 2009.

2. Chirurgie

1. Mannelijke Sprague Dawley ratten (Charles River Laboratories) met een gewicht van 300-350 g werden verdoofd door isofluraan (4% voor de inductie en 2% voor onderhoud) in zuurstof (1 L / min).
2. Zodra de dieren onder het vlak van anesthesie, wordt het dier in een stereotaxisch frame (Kopf Tujunga, CA).
3. Om bloedingen te minimaliseren tijdens de chirurgische ingreep 0,4 ml van lidocaïne (20 mg / ml; Bimeda - MTC Animal Health Inc, Cambridge, Ontario, Canada) met epinefrine wordt intramusculair ingespoten rond de operatiewond in de dorsal halsgebied.
4. Een 4-5 cm dorsale middellijn incisie wordt gemaakt met behulp van een steriel scalpel (# 15), vanaf de basis van de schedel en uitbreiding van caudaal.
5. Steriele Adson pincet worden gebruikt om bot te ontleden door de dorsale spieren van de wervelkolom, en een steriel Alm oprolmechanisme (Fine Science Tools, North Vancouver, BC) wordt ingebracht om de spieren uit elkaar te bereiken.
6. Met behulp van de # 15 scalpel, de spieren die over de bladen van C4-C7 worden afgeschraapt, te beginnen in de middellijn en vegen ze uit zijwaarts.
7. Een insnijding met een steriele scalpel (# 15) aan de spier aan de dwarsuitsteeksels aan beide zijden van de wervelkolom om de klem past onder de dwarsuitsteeksels C4 tot C6.
8. Met een steriele fijne getipt Friedman-Pearson Rongeur (Fine Science Tools, North Vancouver, BC), wordt de linker C5 lamina zorgvuldig verwijderd om de dura en het ruggenmerg zichtbaar te maken.
9. Een staaf met een diameter van 1,5 mm wordt geschoven onder de armenom het dier overeind te houden, waardoor het verhogen van de wervelkolom een ​​beetje en het vergemakkelijken van klem inbrengen.
10. Monteer de kaak van de steriele klem op laterale dwarsuitsteeksels van C4 tot C6 en draai de schroeven.
11. Verwijder de Alm oprolmechanisme.

3. Spinal Cord Injury

1. Nadat de klem gemonteerd op het dier, het dier naar de IH botslichaam.
2. De klem wordt in de metalen houders op de twee middelste stangen van het frame zijn bevestigd onder een hoek van 22,5 ° uit horizontaal (figuur 2).
3. De schaar aansluiting die een stabiele hoogte verstelbaar, (VWR, Mississauga, ON) biedt wordt verhoogd tot het dier ligt plat.
4. Controleer de klem horizontale door een kleine cilinder niveau boven de klem en de schroeven. Het is belangrijk dat alle schroeven goed vast zitten en de set-up is stijf zonder enige beweging.
5. De rest van de procedure wordt uitgevoerd onder MICRoscope (Leica MZ8).
6. Te verlagen en richt de botslichaam tip (15 mm in diameter, met afgeronde hoeken) met behulp van de verticale instelknop en de twee horizontale instelling knoppen op de IH botslichaam tot het midden van het botslichaam tip zweeft boven de top van C6 processus spinosus.
7. Zodra het botslichaam tip in het midden, draait u de y-as instelknop een en twee vijfde afslag (1,4 mm) aan de tip zijdelings te verplaatsen naar de linkerkant en de x-as horizontaal instelknop om het botslichaam tip te verplaatsen naar het centrum van de C5.
8. Laat de tip tot het net boven de dura te controleren of het botslichaam tip is de laterale helft van de grijze stof gericht.
9. Draai de verticale instelling knop twee draait het verhogen van de top 4 mm boven de dura.
10. Zorg ervoor dat de impact gebied is droog met behulp van een wattenstaafje of stok.
11. Stel de gewenste kracht tot 150 kdyn op het programma en klik op "Start Experiment" om het botslichaam te activeren.
12. Na de schade, wordt de wond gesloten Layers met 5-0 Vicryl hechtingen. Buprenorfine (0,03 mg / kg SC, Temgesic, Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ) en zout (10 ml) wordt subcutaan toegediend vóór en tweemaal daags gedurende twee dagen na de operatie. Dieren zijn nauw met elkaar twee keer per dag gecontroleerd op 2 weken en een keer per week gedurende 6 weken na het letsel.

4. Representatieve resultaten

Twintig Negen mannelijke Sprague Dawley ratten (Charles River Laboratories) met een gewicht van 300-350 g raakten gewond bij een kracht-instelling van 150 kdyn. Het botslichaam tip richtte zich 1,4 mm lateraal van middellijn, onder een hoek van 22,5 ° off van verticaal. De gemiddelde werkelijke kracht was 155,55 ± 0,73 kdyn. De gemiddelde verplaatsing is 1512.72 ± 27,86 pm en de snelheid was 120,24 ± 0,52 mm / s (figuur 3).

Gedrag uitkomstmaten

Functioneel herstel werd gemeten met de horizontale ladder test, cilinder opvoeding test, verzorging test,en gewijzigd Montoya trap test ^1. Dieren werden opgeleid voor letsel en beoordeeld op 2, 4 en 6 weken na het letsel. Er waren significante bijzondere waardeverminderingen voorpoot opgelopen gedurende de experimentele periode.

Horizontale Ladder test. Voordat de schade, de dieren slechts 4,75 ± 0,73% fouten op de ipsilaterale voorpoot terwijl doorkruisen over de onregelmatig verdeelde horizontale ladder. Naar aanleiding van de schade, de dieren zien een duidelijke toename in het percentage van de voorpoot fouten. De ipsilaterale voorpoot procent fouten waren 26,97 ± 2,92%, 26,23 ± 2,84% en 22,06 ± 2,05% op 2, 4 en 6 weken na het letsel, respectievelijk (Figuur 4A). Belangrijk is dat de voorpoot bijzondere waardevermindering op deze test die gedurende de 6 weken.

Cilinder Opfok test. Het percentage van de ipsilaterale voorpoot (links + beide) gebruik tijdens de opsporing aanzienlijk gedaald na de SCI.Voorafgaand aan de schade, de dieren die de ipsilaterale voorbeen 75,12 ± 2,25%. Na de schade van de dieren die de ipsilaterale voorbeen 8,59 ± 1,80% bij 2 weken 14,25 ± 2,65% op 4 weken en 11,76 ± 2,66% op 6 weken (Figuur 4B).

Gewijzigd Montoya Trap test. Het aantal pellets opgehaald met de ipsilaterale voorbeen sterk gedaald na het letsel. Voorafgaand aan de schade, de dieren verzamelde 84,85 ± 2,88% van het voedsel beloningen. Echter, op 2, 4 en 6 weken na het letsel, de dieren teruggehaald enige 30,91 ± 4,03%, 28,94 ± 4,38% en 25,86 ± 3,09% van de pellets (Figuur 4C).

Grooming test. Er waren dramatische dalingen in de verzorging scores na letsel. Na SCI, de ipsilaterale verzorging scores waren 2 weken: 2,00 ± 0,17, 4 weken: 1,83 ± 0,17 en 6 weken: 1,79 ± 0,11 (Figure 4D).

Histologische Outcomes

Witte stof en grijze materie sparende. Een voorbeeld van een dwarslaesie bij een kracht van 150 kdyn, hoek van 22,5 ° en laterale doel van 1,4 mm wordt in figuur 5. De blessure heeft geleid tot aanzienlijke schade aan de grijze en witte stof aan de ipsilaterale zijde. Zowel corticospinale en rubrospinal traktaten raakten gewond en 23 van de 29 dieren moesten parenchymale schade die aan de ipsilaterale zijde. De longitudinale omvang van de schade van de witte en grijze stof was 2400 rostraal en 2400 caudaal (Figuur 6). Bij het toevoegen van de sectie om een ​​grove schatting van de "cumulatieve spread" van witte en grijze stof sparende (2000 um rostraal en caudaal van het epicentrum) geven, de ipsilaterale zijde had slechts 51,8% van het gespaarde witte stof en 39,7% van de grijze stof resterende vergeleken met de contralaterale zijde (figuur 6).

Figuur 1. Infinite Horizon dwarslaesie botslichaam. A. Infinite Horizon botslichaam en de algehele ingesteld. B. Kader opgezet. C. Close-up beeld van de klem voor het houden van cervicale dwars-processen. D. Specificatie (eenheid: inch) van de klem. Suggesties voor tolerantie <0,002 in (Choo et al.. 2009). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. A. Afbeelding en bijbehorende frame opgericht ruggenmerg rotatie van 0 ° (neutraal) of B. 22,5 bereiken ° met de laterale doel van 1,4 mm.

Figuur 3. Vertegenwoordiger van kracht en verplaatsing grafieken voor Infinite Horizon botslichaam. De pijl indicates de tijd dat het botslichaam tip heeft 20 kdyn en het moment dat de opname van de verplaatsing wordt gestart bereikt. De optredende wordt gelezen uit de top van de kracht versus tijd curve en de overeenkomstige verplaatsing wordt berekend. Onderstaande grafieken tonen een typische 150 kdyn kneuzing, A. Verplaatsing versus tijd grafiek, B. Force vs Time grafiek. Deze grafieken laten zien dat de bereikte werkelijke kracht was 152 kdyn, en het botslichaam verplaatsing in het koord werd gemeten als zijnde 1287 urn. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4. Behavioral beoordelingen voor kracht van 150 kdyn, botslichaam hoeking van 22,5 ° en het doel van 1,4 mm links van middellijn. A. Horizontale ladder test. B. Cilinder opfok test. C. Gewijzigd Montoya trap test. D. Grooming test. De ipsilaterale voorpoot geleid tot aanzienlijke en duurzaamheidsned bijzondere waardeverminderingen ten opzichte van de contralaterale voorbeen.

Figuur 5. Afbeeldingen slechts ter illustratie van het ruggemerg van rostraal 1600 um te caudale 1600 urn.

Figuur 6. Histologische beoordeling. A. Het percentage witte en grijze stof gespaard. Matter rond 2000 um van het epicentrum van de schade grotendeels werd gespaard. B. Cumulatieve witte en grijze stof gespaard in 2000 um van het epicentrum van de schade. De ipsilaterale zijde had aanzienlijk minder gespaard witte en grijze stof in vergelijking met de contralaterale zijde. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussie

In dit artikel beschrijven we een cervicale eenzijdige contusie model met behulp van de Oneindige Horizon (IH) impactor bij een kracht van 150 kdyn, een hoek van 22,5 ° off van verticale en een laterale doel van 1,4 mm van de middellijn. Met deze instellingen, konden we aanhoudende afwijkend gedrag in de ipsilaterale voorbeen met parenchymale verstoring die grotendeels aan de ipsilaterale kant, waar bleek dat er aanzienlijke schade is ontstaan ​​aan de regio's waar de rubrospinal, reticulospinal, vestibulospinal en ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Benaming van het apparaat	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Infinite Horizon Impactor	Precision Systems en instrumentatie	IH-0400
Aluminium metalen plaat	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Flexaframe ondersteuning voetplaten	Fishers Wetenschappelijk	1466625Q
Flexaframe steunstangen	Fishers Wetenschappelijk	1466610GQ
Flexaframe Ondersteuning Connectors	Fishers Wetenschappelijk	1466620Q
Klem 1	Op maat gemaakt		Choo et al.., 2009
Metalen houders	Op maat gemaakt		Zie hierboven
Impactor tip	Op maat gemaakt		Diameter: 1,15 mm
Stereotaxisch frame	David Kopf Instrumenten	Model 900
Cilinder Level	Yijia TOOLS	YJ-SL0620
Microscoop	Leica		Model #: MZ8
Laboratorium schaar jack	VWR	12620-902