Werkwijze voor ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen te volgen beschreven. Een degron-gedestabiliseerd GFP-(GFP-dgn) en een stabiele GFP-fusie-eiwit dgnFS gegenereerd en wordt getransduceerd in de cel met een lentivirale vector expressie. Deze techniek maakt het mogelijk om een stabiel GFP-dgn/GFP-dgnFS expressie cellijn waarin ubiquitine-proteasoom activiteit gemakkelijk worden bepaald onder toepassing epifluorescentie of flowcytometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Monitoring van ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen door een Degron (dgn)-gedestabiliseerd Green Fluorescent Protein (GFP)-gebaseerde Reporter Protein
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Proteasoom is de belangrijkste intracellulaire organellen betrokken bij de proteolytische afbraak van abnormale, verkeerd gevouwen, beschadigd of geoxideerde eiwitten 1, 2. Onderhoud van proteasoom activiteit werd betrokken bij veel belangrijke cellulaire processen, zoals stress cel respons 3, celcyclus regulatie en cellulaire differentiatie 4 of in het immuunsysteem reactie 5. Het disfunctioneren van de ubiquitine-proteasoom-systeem is gerelateerd aan de ontwikkeling van tumoren en neurodegeneratieve ziekten 4, 6. Daarnaast werd een afname in activiteit gevonden proteasoom als functie van cellulaire ouderdom en veroudering organismale 7, 8, 9, 10. Hier geven we een methode om ubiquitine-proteasoom te meten in levende cellen met een GFP-fusie-eiwit dgn. Om ubiquitine-proteasoom activiteit volgen in levende elementen, complementaire DNA constructen die coderen voor een groen fluorescerend eiwit (GFP)-dgn fusie-eiwit (GFP-dgn, unstable) en een variant die een frameshift mutatie (GFP-dgnFS, stabiele 11) ingevoegd in lentivirale expressievectoren. We verkiezen deze techniek meer traditionele transfectietechnieken omdat het garandeert een zeer hoge transfectie-efficiëntie onafhankelijk van het celtype of de leeftijd van de donor. Het verschil tussen fluorescentie weergegeven door de GFP-dgnFS (stable) eiwit en de gedestabiliseerd eiwit (GFP-dgn) in de afwezigheid of aanwezigheid van proteasoom inhibitor kan worden gebruikt om ubiquitine-proteasoom activiteit schatten in elk afzonderlijk cellijn. Deze verschillen kunnen worden gecontroleerd door epifluorescentiemicroscopie of kan worden gemeten door middel van flowcytometrie.
Protocol
1. Plasmideconstructie
- Om custom oligonucleotiden codeert voor dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) en dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) en ligeren het in de vector pEGFP-C1 de fusie van de GFP met dgn / dgnFS (figuur 1) te verkrijgen.
- Amplificeren van de coderende sequentie voor GFP-dgn en GFP-dgnFS door PCR volgens het protocol van de pENTR Directional TOPO Cloning Kit en zet het pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (Figuur 6).
2. Virusproductie
- De dag voor transfectie (dag 1) zaad uit HEK 293FT cellen in een T75 kolven zodat ze 90-95% confluent op de dag van transfectie zijn.
- Op de dag van transfectie verdunnen 36 pi Lipofectamine 2000 Reagent in 1,5 ml DMEM zonder serum en antibiotica in een 15 ml falcon. Gebruik een andere 15 ml falcon en verdun 3 ug pLenti6/V5 het dragen van de complementaire DNA-construct voor een van beide GFP Dgn-of GFP-dgnFS, 2,5 ug envelop coderend plasmide pMD2.G en 7,5 ug vector backbone psPAX2 in 1,5 ml DMEM zonder serum en antibiotica. Na 5 minuten werd het verdunde DNA wordt gecombineerd met het verdunde Lipofectamine 2000 Reagent.
- Incubeer het mengsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur de DNA-lipofectamine complexen laten vormen.
- Verwijder het medium HEK 293FT cellen voorzichtig vervangen door 7 ml medium (zonder antibiotica) en voeg de DNA-lipofectamine mengsel de kolf en rock heen en weer voor het mengen (dag 2). Incubeer overnacht de kolf bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
- Wijzig medium de volgende dag (10 ml medium zonder antibiotica; Dag 3).
- Na 48 uur (dag 5) oogst supernatant, centrifuge bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en filtreer het supernatant door een 0,45 urn filter PVDF.
Kweekmedium - DMEM (HEK 293FT)
tent "> DMEM10% FBS
0,1 mM MEM NEAA
6 mM L-glutamine
1 mM MEM Natriumpyruvaat
1% Pen-Strep (optioneel)
500 ug / ml Geneticine (optioneel)
3. Virusconcentratie van polyethyleenglycol (PEG) Precipitation
- Voeg een volume polyethyleenglycoloplossing (50 mM polyethyleenglycol, 41 mM NaCl, autoclaaf, pH = 7,2; PEG) tot vier volumes van supernatant en incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C. Meng zorgvuldig het elke 20-30 min. door het omkeren.
- Spin neer 1500 g gedurende 30 min bij 4 ° C. Een witte pellet zichtbaar moeten zijn.
- Zuig het supernatant en centrifugeer bij 1500 xg opnieuw gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig het overblijvende PEG oplossing.
- Resuspendeer de pellet in medium of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door op en neer pipetteren en krachtig vortex gedurende 20 tot 30 seconden. Als richtlijn gebruiken 500 ui voor een T75 kolf aliquot aan 100 pl. Bewaar het virus bij -80 ° C.
- Zaad uit 5 x 10 4 U2-OS cellen aan elke well van een 6-well plaat de dag voor de transfectie.
- Op de dag van transfectie het kweekmedium verwijderd en vervangen door 1 ml DMEM met 8 ug / ml polybreen (hexadimethrine bromide). Verdun de geconcentreerde virus supernatant 1:10 en 1:100 en voeg 1 pl elk aan een putje. Voor hogere concentraties gebruikt virus 1 ul, 5 ul en 10 ul virus supernatant geconcentreerd voor de resterende putjes. Een goed blijft als positieve controle.
- De volgende dag vervangen medium door 2 ml DMEM.
- Begin met de selectie de volgende dag. Breng 10 ug / ml Blasticidine op elk putje. Vervang het antibioticum bevattende medium om de dag.
- Ongeveer 6-7 dagen na het begin van de selectie van de getransduceerde cellen zijn dood. Voor het kleuren Spoel de cellen driemaal met PBS en de cellen bedekken met kristalviolet (10 mg / l kristalvioletin 20% ethanol) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Aspiraat crystal violet (hergebruikt kan worden een paar keer) en tweemaal spoelen de putjes met ddH 2 O en droog de plaat.
- De kolonies en vermenigvuldigen met 1000 en de overeenkomstige verdunning (figuur 7). Deze manier kan worden berekend transfectie eenheden (TU) van het virus / ml.
Kweekmedium - DMEM (HFF-2/U2-OS)
DMEM
10% FBS
6 mM L-glutamine
1% Pen-Strep
5. Transductie van menselijke diploïde fibroblasten (Deze procedure kan worden gebruikt voor elk celtype.)
- Zaad uit 5 x 10 4 humane diploïde fibroblasten (HDF) naar 6-well platen de dag voor transductie.
- Elkaar gebruiken infectiemultipliciteit van twee met 8 ug / ml polybreen als transductie enhancer in totaal een milliliter.
- Wijzig medium de volgende dag.
- Wanneerde cellen bij 70-80% confluentie van start de selectie met 10 ug / ml blasticidine. Na de selectie voltooid (geen getransfecteerde cellen sterven) uitbreiding van de cellen kan beginnen en de cellen klaar voor experimenten. Chronische selectie met blasticidine maakt het genereren van een stabiele cellijn overexpressie GFP-dgn of GFP-fusie-eiwitten dgnFS, bereid proteasoom meten. Deze procedure garandeert een zeer hoge transfectie-efficiëntie onafhankelijk van het celtype.
6. Meting door flowcytometrie
- Zaad uit 1 x 10 5 cellen (die ofwel GFP-dgn of GFP-dgnFS) op de dag voor het experiment.
- Behandelen controlecellen 3 uur vóór de meting met de proteasoomremmer, bijvoorbeeld 100 ug / ml llnl.
- Was tweemaal met PBS en oogst de cellen met 0,5 ml trypsine. Om te stoppen met het trypsinisation gebruik 4,5 ml kweekmedium en breng de cellen om een 15 ml valk.
- Spin thij cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het medium, resuspendeer de cellen in PBS en opnieuw neer bij 300 xg centrifugeren gedurende 5 min bij 37 ° C.
- Zuig het PBS, resuspendeer in 400 ul FACS buffer (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH = 7,4) en breng de cellen in FACS buizen.
- Houd de cellen op ijs en meet monsters door flowcytometrie. De cellen niet opslaan langer dan 30 min bij 4 ° C.
7. Representatieve resultaten
De GFP-fusie-eiwit dgn draagt een sequentie die is gericht op het proteasoom en dus het eiwit onmiddellijk afgebroken en komt overeen met de afname in GFP fluorescentie signaal. De frameshift mutant (GFP-dgnFS) draagt een gemuteerde versie van deze sequentie en niet afgebroken door proteasoom, dat leidt tot hogere groene fluorescentie. Om deze redenen jonge HDF met verwachte hoge proteasoom activiteit en getransduceerd met GFP-dgn n laag (6% positieve cellen) fluorescentiesignaal in zowel flowcytometrie meten en epifluorescentie (figuur 2A en B, figuur 3). Hetzelfde HDF getransduceerd met GFP-dgnFS weer te geven 39,7% van de positieve cellen. De behandeling van de cellen met proteasoomremmer llnl (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal) verhoogde de signaal maximaal 62,9% in zowel GFP-dgn en GFP-dgnFS cellen (figuur 2A en B ).
Om mogelijke daling in proteasoom activiteit in verouderde menselijke huid monsters te bepalen, werden huidfibroblasten geïsoleerd uit jonge, middelbare leeftijd en oude donoren geïnfecteerd met GFP-dgn en GFP-dgnFS, zoals hierboven beschreven en gekweekt in dezelfde passage nummer vóór analyse door stroming cytometrie. In deze experimenten, een duidelijke toename van de GFP-signaal tussen jonge mensen (11,2 ± 0,88% GFP-positieve cellen) en van middelbare leeftijd donoren (20,4 ± 2,27% GFP-positieve cellen, P = 0,003) is waargenomen, wat wijst op een afname van proteasome activiteit in monsters verkregen uit oude donoren 7 (Figuur 4). Geen verdere daling in proteasoom activiteit werd waargenomen in fibroblasten geïsoleerd van oudste personen (Figuur 4). Fluorescentie-intensiteit voor GFP-dgnFS In alle gevallen was ~ 90% (gegevens niet getoond) die een hoge transfectie efficiëntie voor de drie verschillende leeftijdsgroepen aangeeft.
Figuur 1. De GFP-dgn en GFP-dgnFS sequentie. Weergegeven is het 3'-uiteinde van GFP (groen) de meervoudige kloneringsplaats van de vector pEGFP-CL1 (grijs) en de dgn / dgnFS sequentie (rood).
Figuur 2. Flow cytometrie analyse van GFP-dgn en GFP-dgnFS humane diploïde fibroblasten. A. Young humane voorhuidfibroblasten (HFF-2) werden geïnfecteerd met lentivirale vectoren die een groen fluorescerend eiwit (GFP)-dgn gen of een GFP-dgnFS (frameshift) construct, zoals aangegeven en geanalyseerd op GFP-fluorescentie met behulp van flowcytometrie (FACS Canto II, Becton Dickinson). Waar aangegeven, werden de cellen gedurende 3 ook behandeld met proteasoomremmer N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (llnl). Geïnfecteerde cellen werden gebruikt als controle. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud. B. De gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. De cijfers weerspiegelen het aantal GFP positieve cellen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Fluorescentiemicroscopie analyse van GFP-dgn en GFP-dgnFS HFF-2 cellen. Young HFF-2 werden behandeld als in figuur 2. In 9 dagen na infectie werden de cellen visualized door fluorescentie en fasecontrastmicroscopie.
Figuur 4. Veranderingen in proteasoom activiteit in de menselijke veroudering van de huid. De menselijke voorhuid fibroblasten uit negen verschillende donoren in de aangegeven leeftijdsgroepen werden minimaal uitgebreid en geïnfecteerd met lentivirale constructen die coderen voor GFP-dgn. Bij 9 dagen na infectie werden de cellen geanalyseerd door doorstroomcytometrie. De gegevens werden verkregen op drie monsters per leeftijdscategorie in duplo (± SE).
Figuur 5. Experimentele benadering. Maat oligonucleotiden voor dgn en dgnFS worden gekloneerd in de vector pEGFP-C1 en virussen Voor elk construct met HEK 293FT cellen. De titer van het virus wordt bepaald. Cellen getransduceerd met het virus en uitgebreid. Na de voorkeursbehandeling de cellen geanalyseerdvoor fluorescentiesignaal door flowcytometrie.
Figuur 6. Kaart van Plenti GFP-dgn. De kaart van de pLenti6/V5-DEST vector met inbegrip van de GFP-dgn volgorde wordt weergegeven. Afkortingen: PCMV (CMV promoter), GFP-dgn (sequentie van GFP-dgn), P SV40 (SV40 vroege promotor), EM7 (EM7 promotor), Blasticidine (Blasticidine resistent gen), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR met verwijderd U3-gebied), SV40 pA (SV40 polyadenyleringssignaal), ampicilline (ampicillineresistentiegen), pUC ori (pUC oorsprong), pRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR hybride promoter), Ψ (HIV-1 verpakkingssignaal Ψ ), RRE (HIV-1 Rev response element).
Figuur 7. U2-OS titreren plaat. U2-OS werden gezaaid op een 6-well plaat en getransfecteerd met verschillende concentraties virus (verdunning van 1/100 en 1/10, 1, 5 en 10 pi concentrated virale supernatant). Een putje werd gebruikt als ongetransfecteerde controle (NT). Na 6-7 dagen werden de cellen gekleurd met kristalviolet en luchtgedroogd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De eerste publicatie met green fluorescent protein (GFP) als reporter substraat voor ubiquitine-proteasoom-activiteit werd gepubliceerd in 2000 12. Sindsdien is GFP uitgegroeid tot een gemeenschappelijk instrument om cellulaire activiteiten, in het bijzonder het ubiquitine-proteasoom-proces te visualiseren. Om ubiquitine-proteasoom activiteit in vivo volgen van een transgeen muismodel met een GFP-reporter gebaseerde geïntroduceerd 13. Extra in vivo onderzoek bleek een transgeen mu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door: National Research Network on Aging (NFN S93) door de Oostenrijkse Science Foundation (FWF), Europese Commissie geïntegreerde projecten MiMAGE en PROTEOMAGE, Nederland Genomics Initiative / Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NGI / NWO, 05040202 en 050 - 060 tot 810 NCHA), de door de EU gefinancierde Network of Excellence Levensduur (KP6 036.894), en Innovatiegerichte onderzoeksprogramma over Genomics (SenterNovem, IGE01014 en IGE5007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6,084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagens | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 | |
| Polyethyleenglycol | Sigma | P2139 | |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's fosfaat gebufferde Sali1x ne (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 | |
| Blasticidine | Invitrogen | R21001 | |
| Kristalviolet | Sigma | C3886 | |
| FACS buisjes | BD Biosciences | ||
| Penicilline streptomycine (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Foetaal runderserum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Niet-essentiële aminozuren (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Natriumpyruvaat 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-glucose (45%) | Sigma | G8769 | |
| Geneticine | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck | C5080 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Trypsine-EDTA (0,05%) | Invitrogen | 25300054 |
Referenties
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
