Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
TGF-β heeft tegengestelde rollen in borstkanker progressie door te fungeren als een tumor suppressor in de beginfase, maar het stimuleren van invasie en metastase in een later stadium 1,2. Bovendien is TGF-β vaak tot overexpressie gebracht in borstkanker en de uitdrukking ervan correleert met een slechte prognose en metastase 3,4. De mechanismen waarmee TGF-β induceert invasie niet goed begrepen.
TGF-β lokt haar cellulaire reacties via TGF-β type II (TβRII) en type I (TβRI) receptoren. Bij de TGF-β-geïnduceerde heteromeric complex vorming, TβRII fosforyleert de TβRI. De geactiveerde TβRI initieert zijn intracellulaire canonieke signaalroute door fosforylatie receptor Smads (R-Smads), dat wil zeggen Smad2 en Smad3. Deze geactiveerde R-Smads vorm heteromeric complexen met Smad4, die zich ophopen in de kern en het reguleren van de transcriptie van doelwitgenen 5. In aanvulling op de eerder described Smad pad, receptor activering resulteert in de activering van een aantal andere niet-Smad signaalwegen, bijvoorbeeld Mitogeen Activated Protein Kinase (MAPK) wegen 6.
De studie van de rol van TGF-β in verschillende stadia van borstkanker, hebben we gebruik gemaakt van de MCF10A cel systeem. Dit systeem bestaat uit spontaan vereeuwigd MCF10A1 (M1) borst epitheelcellen 7, de H-RAS getransformeerd M1-derivaat MCF10AneoT (M2), die premaligne letsels veroorzaakt bij muizen 8, en de M2-afgeleide MCF10CA1a (M4), dat werd vastgesteld op basis van M2 xenografts en vormen hoogwaardig carcinomen met de mogelijkheid om uitzaaien naar de longen 9. Dit MCF10A serie biedt de mogelijkheid om de reacties van cellen te bestuderen met verschillende graden van maligniteit die niet vertekend door een verschillende genetische achtergrond.
Voor de analyse van TGF-β-geïnduceerde invasie genereerden wij homotypic MCF10A sferoïde celculturen embeT OEGEVOEGDE in een 3D-collageen-matrix in vitro (figuur 1). Dergelijke modellen sterk lijken op menselijke tumoren in vivo door de oprichting van een gradiënt van zuurstof en voedingsstoffen, wat resulteert in actieve en invasieve cellen aan de buitenkant en rustende of zelfs necrotische cellen in de binnenkant van de sferoïde 10. Sferoïde gebaseerde testen hebben ook aangetoond dat resistentie tegen geneesmiddelen beter samenvatten dan monolaagculturen 11. Dit MCF10 3D-model-systeem liet ons toe om de impact van de TGF-β signalering te onderzoeken op de invasieve eigenschappen van borst-cellen in verschillende stadia van maligniteit.
Protocol
1. Voorbereiding van de Methocel oplossing (500 ml)
- Autoclaaf 6 g methylcellulose in een 500 ml fles met een magneetroerder.
- Los van de methylcellulose in 250 ml voorverwarmd DMEM/F12 zonder serum (60 ° C) gedurende 20 minuten.
- Voeg 250 ml van DMEM/F12 (RT) met 10% paard serum. Mix 's nachts (4 ° C).
- Wis de oplossing door centrifugeren (5000g, 2h, 4 ° C).
- Neem het heldere zeer viskeuze oplossing voor een nieuwe buis (ongeveer 90-95% van de voorraad-oplossing).
- Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
2. Sferoïde cultuur
- Bereid een 20% Methocel-oplossing (10 ml en 40 ml Methocel groeimedium).
- Twee keer wassen cellen met PBS, voeg 0,1% trypsine en incubeer cellen bij 37 ° C
- Resuspendeer cellen in groeimedium en tellen de cellen.
- Maak een suspensie van 10 000 cellen per ml in 20% Methocel.
- Voeg de celsuspensie aan de 96 goed met ronde bodem suspension platen (100 ul per putje).
- De volgende dag, controleer dan de bolvormige formatie in de suspensie platen. Sferoïden klaar voor gebruik na 1-3 dagen.
3. Vervaardiging van collageen
- Voor te bereiden op het ijs een oplossing van 8 ml collageen, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH en 3 druppels 0,1 N HCl. Controleer of de pH 7,4 door het spotten van een deel van de oplossing op pH-indicator strips. Stel de pH indien buiten bereik.
- Voeg 50 ul van geneutraliseerd collageen-oplossing in de putjes van een plaat met 96 putjes
- Incubeer bij 37 ° C totdat het collageen is gestold (90 min).
- Bereid Methocel-collageen-ligand-oplossingen op het ijs: voor elke ligand pipet een deel van de oplossing van collageen. Voeg 20 ng per ml TGF-β collageen. Na verdunning met Methocel en de verspreiding over de verschillende lagen, zal de uiteindelijke concentratie van TGF-β worden 5 ng / ml Meng door vortexen. Voeg een deel van Methocel-oplossing. En door vortexen gemengd.
4. Sferoïde insluitenDing
- Plaats een 200 ul tip dat ongeveer 5 mm van de tip afgesneden heeft, op een 200 ul pipet. Zuigen een sferoïde met de pipet en zorgvuldig het medium afzien in een leeg bord. Kijk als de bolvormige blijft binnen de tip. De sferoïde is zichtbaar als een witte stip. Zonder dat het loslaten van de zuiger, zuigen 100 ul collageen-Methocel mengsel en afzien van de spheroïde in het collageen mengsel in een collageen gecoate 96 well. Doe dit voor 12 sferoïden voor elke conditie.
- Laat collageen ten minste 30 minuten stollen bij 37 ° C
- Verwijder de luchtbellen met een 200 ul tip.
- Voeg 50 pl medium met 1,6% serum en inhibitoren opgelost in DMSO. Voor de SB-431542 toe te voegen 4 pl stockoplossing (10 mm) tot 1 ml medium. Na de diffusie, zal de uiteindelijke concentratie van de remmer worden 10 uM. TGF-β en remmers blijven de loop van het experiment. Maak foto's van de sferoïden onder de microscoop met behulp van 40x vergroting.
- Na 48h van de stimulatie met TGF-β en / of remmers, foto's nemen van de sferoïden onder de microscoop met behulp van 40x vergroting.
- Meet de oppervlakte van de binnenvallende sferoïden na 2 dagen en trek het startgebied. Het meten van de oppervlakte van een sferoïde: Open het beeld van de sferoïde in Adobe Photoshop Extended (figuur 2A) en selecteer het gereedschap Snelle selectie (figuur 2B). De muisaanwijzer verandert in een cirkel met een 'plus' (+) teken (figuur 2C). Tijdens het slepen met de cursor over de afgeplatte bol is, zal Photoshop herkent de grenzen van de sferoïde. Als een gebied buiten de sferoïde is geselecteerd, kan dit gebied worden uitgesloten van de selectie door op de Alt-toets of door gebruik te maken van de negatieve selectie tool die wordt aangegeven door een (-) teken in de werkbalk. De cursor verandert in een cirkel met een 'min' (-) teken en door het slepen van de cursor over de verkeerd gekozen gebied, is dit gebied uit de selectie verwijderd (figuur 2D). Indien nodig, meerdere regio's kunnen worden geselecteerd door op de ShIFT-knop. Om te werken nauwkeuriger, kan de grootte van de muisaanwijzer worden aangepast door het veranderen van de borstel diameter in de werkbalk (figuur 2E). Wanneer de hele sferoïde is geselecteerd, is de oppervlakte van de selectie berekende via analyse-maatregel in de menubalk of door te drukken op Ctrl + Shift + M (figuur 2F). De meting opname venster verschijnt met de bestandsnaam en het gebied van de selectie in pixels, evenals andere gegevens (figuur 2G). Als er meerdere selecties worden gemeten, de eerste regel geeft de som van alle gebieden. De metingen van de individuele selecties worden gepresenteerd in de lijnen hieronder. De gegevens van alle metingen kunnen worden geëxporteerd naar een tekstbestand en geopend in Excel.
5. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van de bolvormige assay met MCF10A1 (M1) normale borst-epitheliale cellen, H-RAS getransformeerd MCF10AneoT (M2) cellen en M2-afgeleide MCF10CA1a (M4) wordt gegeven in figuur 3. M1 cellen toonde slechts zwakke invasie zonderstimulatie, maar viel significant beter op stimulatie door TGF-β. In tegenstelling, de RAS-getransformeerde M1-M2 afgeleide binnengevallen efficiënt al zonder toevoeging van stimuli, en dit werd verder verhoogd 4-5 keer op TGF-β behandeling. M4 cellen toonde de sterkste invasie, zowel met als zonder TGF-β toevoeging.
Vervolgens onderzochten we of we konden met de TGF-β-geïnduceerde invasie grijpen in dit bolvormige model met behulp van chemische remmers. Voor dit doel gebruiken we SB-431542, een ATP-analoog en selectieve remmer van de kinase-activiteit van TβRI, evenals activine type IB receptor (ActRIB) en activine receptor-like kinase (ALK) 7 12. Zoals verwacht, SB-431542 krachtig remde TGF-β-geïnduceerde invasie van M1, M2 en M4 cellen (afb. 4), wat aangeeft dat TGF-β-geïnduceerde invasie is TβRI-kinase afhankelijk. Daarnaast is de basale invasie van de sferoïden ook werd sterk geremd, wat suggereert dat basale inval is ook deonafhankelijke op de TGF-β.
Figuur 1. Stroomdiagram van de 3D-sferoïde test. Eerst worden de cellen geplateerd onder niet-klevende omstandigheden in u-vormige suspensies platen. Cellen aggregrate in multcellular sferoïden en kan worden ingebed in een collageen matrix. In dit collageen matrix, zijn ze in staat om binnen te vallen.
Figuur 2. Kwantificering van de oppervlakte van de sferoïden met behulp van Adobe Photoshop Extended. (A) Het beeld van de bolvormige wordt geopend in Adobe Photoshop Extendend (B) Selectie van het gereedschap Snelle selectie (C) Het slepen van de cursor over de bolvormige op het gebied van de bolvormige (D) Verwijdering van een wongly opgenomen gebied met behulp van de te selecteren negatieve gereedschap Snelle selectie (E) Aanpassing van de borstel grootte van het gereedschap Snelle selectie om nauwkeuriger Selecteer het gebied dat (F) Selectie van demeting op te nemen opdracht (G) Voorbeeld van een meting op te nemen.
Figuur 3. TGF-β-geïnduceerde invasie van sferoïden van spontaan vereeuwigd MCF10A1 (M1) (A), RAS-getransformeerde MCF10AneoT (M2 (B) en haar uitgezaaide afgeleide MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 en M4 spheroids embedded in collageen werden behandeld met 5ng/ml van TGF-β voor 48u zoals aangegeven. AC vertegenwoordiger van foto's genomen op de dag van inbedding en twee dagen later. D Relatieve invasie werd gekwantificeerd als gebied verschil op dag 2 minus dag 0. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± sd Aangepast uit 13.
Figuur 4. Basal en TGF-β-geïnduceerde sferoïde invasie wordt geremd by SB-431542. M1, M2 en M4 spheroids werden ingebed in collageen en behandeld met TGF-β 5ng/ml en / of 10 uM SB-431.542 zoals aangegeven. Vertegenwoordiger van foto's genomen na 2 dagen (A). Relatieve invasie werd gekwantificeerd als gebied verschil op dag 2 minus dag 0 (B). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± sd Aangepast uit 13.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben een sferoïde model waarin MCF10A1 cellen en zijn kwaadaardige derivaten binnen te vallen in een collageen matrix in een TGF-β-afhankelijke manier. Eerst worden sferoïden gevormd in 96-wells ronde bodem schorsing platen in de aanwezigheid van methylcellulose. Natuurlijk kan ook de U-vormige poly-HEMA gecoate platen worden gebruikt voor dit doel. Methylcellulose is absoluut noodzakelijk in deze stap, aangezien cellen zullen sterven in de afwezigheid van methylcellulose. TGF-β wordt direct toegevoegd aan de colla...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar dat Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, USA) voor de reagentia en Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Kanker Intitute, Detroit, USA) voor de cellijnen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | Commentaar (optioneel) |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Geavanceerde BioMatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well schorsing platen | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| 96-well hechting TC platen | Greiner Bio-One | 655 180 |
Referenties
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
