Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Summary

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Abstract

Bacteriële vaginose (BV) is een terugkerend polymicrobiële syndroom dat wordt gekenmerkt door een verandering in de "normale" microbiota van Lactobacillus gedomineerde naar een microbiota gedomineerd door een aantal bacteriesoorten, zoals Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, en anderen ^1-3. Deze voorwaarde wordt in verband gebracht met een reeks van negatieve gevolgen voor de gezondheid, met inbegrip van HIV acquisitie ^4, en het kan moeilijk zijn om klinisch ⁵ beheren. Bovendien heeft de diagnose van BV zich op het gebruik van Gramkleuringen van vaginale uitstrijkje uitstrijkjes die worden gescoord op verschillende numerieke criteria ^6,7. Terwijl deze diagnose is eenvoudig, goedkoop, en goed geschikt voor gebieden met beperkte middelen, kan het last hebben van problemen met betrekking tot subjectieve interpretaties en het niet geven een gedetailleerd profiel van de samenstelling van de microbiota vaginale ^8. Recente diepe sequencing inspanningen hebben aangetoond een rijke, gevarieerde vaginale microbiota metduidelijke verschillen tussen de monsters genomen van individuen die met BV gediagnosticeerd in vergelijking met de personen die worden beschouwd als normaal ^9,10, hetgeen heeft geresulteerd in de identificatie van een aantal potentiële doelwitten voor moleculaire diagnose van BV ^11,12. Deze studies hebben een schat aan nuttige informatie, maar diep sequencing is nog niet praktisch als een diagnostische methode in een klinische setting. We hebben onlangs een werkwijze beschreven voor het snel profilering van de vaginale microbiota in een multiplex formaat met behulp van oligonucleotide-gekoppeld fluorescerende kralen met detectie op een Luminex platform ^13. Deze methode, als de huidige Gramkleuring-gebaseerde methoden, is snel en eenvoudig, maar voegt het extra voordeel van de exploitatie van moleculaire kennis die voortvloeit uit sequencing studies in probe design. Deze methode geeft daarom een ​​manier om de belangrijkste micro-organismen die aanwezig zijn in een vaginale uitstrijkje dat kan worden gebruikt om de BV diagnose met een hoge specificiteit en sensitiviteit comp profielared om Gramkleuring terwijl aanvullende informatie over de soorten aanwezigheid en overvloed in een semi-kwantitatieve en snelle manier. Deze multiplex methode is uit te breiden tot ver buiten het bereik van de huidige kwantitatieve PCR assays voor bepaalde organismen, die momenteel beperkt tot 5 of 6 verschillende assays in een enkel monster ^14. Belangrijk is dat de methode niet beperkt tot de detectie van bacteriën in vaginale swabs en kan eenvoudig aangepast worden om snel het profiel van bijna alle microbiële gemeenschap van belang. Zo hebben we onlangs begonnen met deze methodiek van toepassing zijn op de ontwikkeling van diagnostische tools voor het gebruik in waterzuiveringsinstallaties.

Protocol

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Dumonceaux et al.. J. Clin. . Microbiol 47, 4067 tot 4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Een schematisch diagram dat de totale procedure is weergegeven in figuur 1.

1. Bead koppeling

Dit beschrijft de methoden die moeten worden gebruikt voor het koppelen van oligonucleotide probes om polystyreen Luminex kralen (zie tabel 2). Volumes zijn licht aangepast voor de evaluatie van nieuwe vangprobes op proef, deze volumes zijn tussen haakjes vermeld.

1. Verwijder een-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimi....

Discussion

De specificiteit van het signaal generatie is van cruciaal belang, je moet erop kunnen vertrouwen dat het signaal waargenomen werkelijk weerspiegelt de detectie van amplicon gegenereerd op basis van dat organisme. Software zoals PrimerPlex (Premier Biosoft) kan helpen om probes die efficiënt zal hybridiseren het ontwerp, maar ze kunnen wel of niet cross-hybridiseren niet-doelsoorten. Indien een universele PCR-primers worden gebruikt zoals beschreven in dit protocol, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de geg.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide naam	Vennootschap	Sequence een
H279BP	Invitrogen, IDT, of andere	Biotine-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Biotine-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, fosforothioaat-C, E, fosforothioaat-G, F, fosforothioaat-A, I, inosine, Y, C of T, R, A of G; K, T of G, S, C of G.

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC)	Doorboren	22980
Fluorescerende polystyreen parels: MicroPlex microsferen (Luminex), of Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad)	Luminex of Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx waarbij xxx staat voor de hiel identifier	Magnetische kralen zijn steeds beschikbaar voor oligonucleotide koppeling en kan bepaalde voordelen. Niet zijn berecht door deze auteurs.
Capture oligonucleotiden (5 'amino C12 gewijzigd)	Invitrogen, IDT, of andere	verschillende	Ontzout zuiverheid niveau acceptabel is. Sequenties van de vangprobes gebruikt om de vaginale swabs karakteriseren zijn te vinden in het manuscript waarop dit protocol is gebaseerd 13.
T7exonuclease	New England Biolabs	M0263S
Streptavidine-R-phycoerythrin (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Wees voorzichtig met hoge zuiverheid SA-PE te verkrijgen; deze catalogus nummer is aan te bevelen
Beschermbuis 96 goed PCR-platen	Visser	CS006509	passen in zowel de 96-wells thermocycler en Bioplex machine
Beschermbuis afdichting mat	Visser	CS006555	Kan worden hergebruikt; wassen met water en zeep, goed afspoelen en droog
5M TMAC	Sigma	T3411
Bio-Plex of Luminex instrument	Bio-Rad of Luminex	Bio-Rad: 171-000201
PrimerPlex software voor probe ontwerp	Premier Biosoft	www.premierbiosoft.com	Aanbevolen voor Luminex sonde deteken, hoewel andere software platformen kan worden gebruikt

bestanddeel	ul / test	μl/100 assays	uiteindelijke concentratie
10x PCR buffer (Invitrogen)	5	500	1x
50 mM MgCl2 (Invitrogen)	2.5	250	2,5 mM
10 mM dNTP	1	100	0,2 mM elk
H279BP, 25 uM	0,25	25	375 nM
H1612BP, 25 uM	0,75	75	125 nM
H280, 25 uM	0,25	25	375 nM
H1613,25 uM	0,75	75	125 nM
Water	34	3400	---
Totalen	44,5	4450