Methodenartikel

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

DOI:

10.3791/3399

⸱

17 november 2011

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol zal de extractie en analyse van vrije en geësterde bioactieve vetzuren uit cellen demonstreren. Vetzuren worden nauwkeurig gekwantificeerd met behulp van stabiele isotoopverdunning, chirale vloeistofchromatografie, electronenvangst-atmosferische chemische ionisatie-meervoudige reactiebewaking massaspectrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het metabolisme van vetzuren, zoals arachidonzuur (AA) en linolzuur (LA), resulteert in de vorming van geoxideerde bioactieve lipiden, inclusief talrijke stereo-isomeren1,2. Deze metabolieten kunnen worden gevormd uit vrije of geesterde vetzuren. Veel van deze geoxideerde metabolieten hebben biologische activiteit en zijn betrokken geweest bij verschillende ziekten, waaronder cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten, astma en kanker3-7. Geoxideerde bioactieve lipiden kunnen enzymatisch worden gevormd of door reactieve zuurstofsoorten (ROS). Enzymen die vetzuren metaboliseren omvatten cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO) en cytochroom P450 (CYPs)1,8. Enzymatische metabolisme resulteert in enantioselectief vorming terwijl ROS-oxidatie resulteert in de racemische vorming van producten.

Hoewel dit protocol zich voornamelijk richt op de analyse van AA- en enkele LA-afgeleide bioactieve metabolieten; kan het gemakkelijk worden toegepast op metabolieten van andere vetzuren. Bioactieve lipiden worden uit cellysaat of media geëxtraheerd met behulp van vloeistof-vloeistof (l-l) extractie. Aan het begin van het l-l-extractieproces worden stabiele isotoop interne standaarden toegevoegd om rekening te houden met fouten tijdens de monstervoorbereiding. Stabiele isotoopverdunning (SID) houdt ook rekening met eventuele verschillen, zoals ionisatiedemping, die metabolieten kunnen ervaren tijdens de massaspectrometrie (MS) analyse9. Na de extractie wordt derivatisering met een elektronvanger (EC) reagens, pentafluorylbenzylbromide (PFB) toegepast om de detectiegevoeligheid te verhogen10,11. Meervoudige reactiebewaking (MRM) wordt gebruikt om de selectiviteit van de MS-analyse te verhogen. Voor MS-analyse worden lipiden gescheiden met behulp van chirale normale fase hogeprestatievloeistofchromatografie (HPLC). De HPLC-omstandigheden zijn geoptimaliseerd om de enantiomeren en verschillende stereo-isomeren van de gemonitorde lipiden te scheiden12. Deze specifieke LC-MS-methode monitort prostaglandinen (PG's), isoprostanes (isoP's), hydroxyicosatetraeenzuur (HETE's), hydroxyoctadecadieenzuur (HODE's), oxoicosatetraeenzuur (oxoET's) en oxooctadecadieenzuur (oxoOD's); de HPLC- en MS-parameters kunnen echter worden geoptimaliseerd om enige vetzuurmetabolieten op te nemen13.

De meeste van de momenteel beschikbare bioanalytische methoden houden geen rekening met de afzonderlijke kwantificering van enantiomeren. Dit is uiterst belangrijk wanneer wordt getracht af te leiden of de metabolieten enzymatisch of door ROS zijn gevormd. Bovendien kunnen de verhoudingen van de enantiomeren bewijs leveren voor een specifiek enzymatische vormingsroute. Het gebruik van SID maakt nauwkeurige kwantificering van metabolieten mogelijk en houdt rekening met eventueel monsterverlies tijdens de voorbereiding evenals de verschillen die tijdens ionisatie worden ervaren. Het gebruik van de PFB-elektronvanger verhoogt de detectiegevoeligheid met twee ordes van grootte ten opzichte van conventionele APCI-methoden. Over het algemeen is deze methode, SID-LC-EC-atmosferische druk chemische ionisatie APCI-MRM/MS, een van de meest gevoelige, selectieve en nauwkeurige kwantificeringsmethoden voor bioactieve lipiden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Standard en interne standaardmixen

  1. Voor de lipidextractie moet men een standaardmix (SM) en een interne standaardmix (ISM) bereiden. Voor de SM, gebruik een gekalibreerd spuitje om het gelijkwaardige volume van 1 μg van elke standaard (totaal 25) die in de onderstaande reagentietabel staan vermeld, te pipetten in een 10 mL volumetrische kolf. Droog de standaarden onder stikstof en stel ze weer op in 10 mL acetonitril (ACN). De uiteindelijke concentratie van de standaardmix zal 100 pg/μL zijn. Verdeel in 1 mL aliquoten en bewaar bij -80°C tot ze nodig zijn.
  2. Uit deze standaardmix kunnen 6 standaardverdunningen worden gemaakt voor een totaal van 7 kalibratiestandaarden (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL en 100 pg/ μL). Deze standaarden moeten samen met elke batch monsters worden uitgevoerd die worden voorbereid om de kalibratiecurve te ontwikkelen die wordt gebruikt bij kwantitatieve analyse.
  3. Voor de ISM, gebruik een gekalibreerd spuitje om het gelijkwaardige volume van 1 μg van elke IS (totaal 14) die in de onderstaande reagentietabel staan vermeld, te pipetten in een 10 mL volumetrische kolf en droog deze onder stikstof. Stel de ISM weer op in 10 mL ACN en verdeel in 1 mL aliquoten. De uiteindelijke concentratie van de ISM moet 100 pg/μL zijn. Er is genoeg ISM om 1000 monsters te verwerken.
  4. Bewaar de SM en ISM bij -80°C.

2. Collectie van media en cellysaat

  1. Voor elke 10 cm plaat van adherente cellen (~ 1 X 107), verzamel 3 mL media in een 10 mL glazen centrifugeerbuis. Was vervolgens de cellen 2 keer met fosfaat gebufferd zout (PBS). Voeg 1 mL PBS toe aan de plaat en schraap de cellen van de plaat en pipet ze in een tweede 10 mL glazen centrifugeerbuis. Op dit punt kunnen cellen en media worden opgeslagen als de procedure niet onmiddellijk wordt voortgezet. Bewaar monsters bij -80°C voor langdurige opslag of bij -20°C voor minder dan een week.

3. Extractie van lipiden uit media

  1. Vrije bioactieve lipiden worden gevonden in de cell media en deze worden gemakkelijk geëxtraheerd met een één-staps l-l extractieprocedure. Voeg aan het verzamelde media (2.1) 10 μL ISM toe. Op dit moment moeten 8 extra 10 mL glazen centrifugeerbuizen worden gelabeld #0-7 voor de kalibratiestandaarden. Voeg 3 mL PBS toe aan elk van deze buizen en voeg vervolgens 10 μL van de juiste SM toe aan buizen 1-7 (1-7 van 1.1).
  2. Laat de ISM 10 minuten in elk kalibratiestandaard en monster gelijkwaardig worden en voeg vervolgens 5 mL di-ethylether toe. De monsters en kalibratiestandaarden worden vervolgens op lage snelheid gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de shaker geplaatst.
  3. Na het schudden worden alle kalibratiestandaarden en monsters gedurende 10 minuten bij 1935 x g gecentrifugeerd. Vervolgens wordt met een Pasteur pipet de bovenste fase (organisch) overgebracht naar een nieuwe 10 mL glazen centrifugeerbuis en gedroogd onder stikstof.

4. Extractie van lipiden uit cellysaat

  1. Spin de cell monsters in de glazen centrifugeerbuizen bij 1935 X g gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg; voeg 2 mL PBS toe aan elke buis en vortex kort. Verwijder 25 μL monster voor eiwitkwantificering. Het totale eiwit wordt gebruikt voor normalisatie van cellysaat.
  2. Vervolgens wordt de helft van het lysaat/PBS mengsel overgebracht naar een aparte 10 mL glazen centrifugeerbuis. Voeg aan elk monster een extra 2 mL PBS toe samen met 10 μL ISM. Volg het l-l extractieproces dat voor media wordt beschreven in 3.2 en 3.3. Deze aliquot zal worden gebruikt om vrije lipiden in de cellen te meten en alkalische afbraak van lipiden, zoals de prostaglandinen, te voorkomen. Deze aliquot ondergaat niet de stappen 4.3 en 4.4 die hieronder worden beschreven.
  3. De eerste stap van het geesterde lipiden l-l extractieproces vereist de toevoeging van 5 mL van CHCl3/MeOH (2:1) aan elk van de monsters. De monsters worden in een shaker op lage snelheid gedurende 30 minuten geplaatst. Na het schudden worden de monsters gedurende 10 minuten bij 1935 x g gecentrifugeerd. Vervolgens wordt met een Pasteur pipet de onderste (organische) laag van de l-l extractie overgebracht naar een nieuwe 10 mL glazen centrifugeerbuis en wordt het monster onder stikstof gedroogd.
  4. Geesterde lipiden moeten worden gesaponiseerd voordat ze worden gekwantificeerd. Nadat de monsters droog zijn, voeg 0,5 mL van 0,4N KOH in 80% MeOH toe aan elke buis. De monsters worden vervolgens 1 uur bij 60°C bewaard. Na de incubatie, voeg 2 mL PBS toe. Pas de pH aan tot 6 met geconcentreerd HCl zuur (~30 μL). Voeg 10 μL ISM toe aan elk monster. De rest van de procedure is hetzelfde als lipidenextractie uit media en kan worden gevolgd in 3.2 en 3.3.
  5. Als deze extracties gelijktijdig met de mediamonsters worden uitgevoerd, kunnen dezelfde kalibratiestandaarden worden gebruikt om een kalibratiecurve te ontwikkelen; als deze monsters op een ander tijdstip worden uitgevoerd, moeten kalibratiestandaarden ook worden verwerkt zoals beschreven in 3.1-3.3.

5. Pentafluorylbenzylbromide (PFB) derivatisering

  1. Aan de gedroogd monsters en kalibratiestandaarden, voeg 100 μL anhydrisch dichloromethaan (CH2Cl2) toe gevolgd door 100 μL van 20% (v/v) N,N-di-isopropylethylamine in anhydr

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De standaarden en interne standaarden die in dit protocol worden gebruikt, geven een weergave van een gerichte lipidomics-methode. Een Waters 2695-scheidingsmodule en Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra werden gebruikt voor de LC-MS-analyse en de optimale parameterinstellingen zijn te vinden in Tabel 1 en Tabel 2. Bovendien is dit extractieprotocol ontworpen voor aderente cellen, maar kan het worden aangepast voor andere celtypen en andere biologische matrices, waaronder urine, bloed en weef...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten zijn gedeclareerd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste huidige bioanalytische methoden die beschikbaar zijn voor de meting van bioactieve lipiden zijn niet zo uitgebreid omdat ze geen chirale normale fase-chromatografie of SID omvatten. Chirale normale fase LC is cruciaal voor de scheiding van enantiomeren en om onderscheid te kunnen maken tussen enzym- of ROS-gemedieerde metabolisme. Het gebruik van SID zorgt ervoor dat menselijke fouten of complicaties die optreden tijdens extractie of analyse, worden meegenomen tijdens kwantificering. Deze toegevoegde componenten samen met ECAPCI-MRM maken dit de meest gevoelige, selectieve methode die beschikbaar is voor de analyse van bioactieve lipiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7 acidCayman Chemical334250[2H7]-5-ox–TE Internal Standard
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acidCayman Chemical334230[2H8]-5(S)-HETE Internal Standard
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acidCayman Chemical334570[2H8]-12(S)-HETE Internal Standard
15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acidCayman Chemical334720[2H8]-15(S)-HETE Internal Standard
20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-16,16,17,17,18,18-d6 acidCayman Chemical390030[2H6]-20-HETE Internal Standard
9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 acidCayman Chemical338410[2H4]-9(S)-HODE Internal Standard
13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 acidCayman Chemical338610[2H4]-13(S)-HODE Internal Standard
9α,11α,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acidCayman Chemical316010[2H4]-PGF2α Internal Standard
9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acidCayman Chemical316350[2H4]-8-iso-PGF2a Internal Standard
9α,11β.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acidCayman Chemical10008989[2H4]-11β-PGF2 Internal Standard
9α,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acidCayman Chemical312010[2H4]-PGD2 Internal Standard
9-oxo-11α,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acidCayman Chemical314010[2H4]-PGE2 Internal Standard
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 acidCayman Chemical320110[2H4]-LTB4 Internal Standard
9α,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acidCayman Chemical319030[2H4]-TxB2 Internal Standard
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical342505-ox–TE Standard
12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3458012-ox–TE Standard
15-oxo-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3473015-ox–TE Standard
5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical342255(R)-HETE Standard
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical342305(S)-HETE Standard
8R-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical343508(R)-HETE Standard
8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical343608(S)-HETE Standard
11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3450511(R)-HETE Standard
11S-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3451011(S)-HETE Standard
12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
  2. Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).
  3. Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer. Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).
  4. Basu, S. Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology. Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).
  5. Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).
  6. Hersberger, M. Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins. Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).
  7. Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics. J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).
  8. Capdevila, J. H., Falck, J. R. Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).
  9. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).
  10. Blair, I. A. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators. Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).
  11. Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range. Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).
  12. Blair, I. A. Encyclopedia of Mass Spectrometry. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).
  13. Lee, S. H., Blair, I. A. Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS). Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Derivatisatie voor elektronenvangstchirale normale fase HPLCmultiple reaction monitoringextractie van bioactieve lipidenvloeistof vloeistofextractiearachidonzuurmetabolietenlinolzuurmetabolietenenantiomeerscheiding

Gerelateerde artikelen