Cellen spelen een instrumentele en steeds grotere rol in het onderzoek, en de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe therapeutica. Met deze toenemende behoefte aan een groter aantal cellen we hebben meer efficiënte en effectieve manieren voor het kweken en oogsten van gehechtheid afhankelijke cellen. Een meerlaagse kolf met de juiste functies kan dienen dit doel.
Methodenartikel
Opschaling van zoogdiercelculturen met behulp van een nieuw Meerlaagse Flask
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een groeiend aantal cel-gebaseerde toepassingen vereisen een groot aantal cellen. Gebruik van een laag T-flessen, dat er voldoende zijn tijdens kleinschalige uitbreiding, kan omslachtig, arbeidsintensief en tijdrovend wanneer grote aantallen cellen nodig zijn. Om aan deze behoefte, de prestaties van een nieuwe multi-layered celkweek schip een gemakkelijke schaal vergemakkelijken van cellen uit een gelaagde T-kolven zullen worden besproken. De geteste kolven zijn leverbaar in 3 - en 5-layer formaat en respectievelijk in staat stellen cultuur en volledig herstel van drie en vijf keer het aantal cellen, in vergelijking met T-175 flessen. Een belangrijk kenmerk van de BD Multi-Flask is een mix / evenwicht poort die het mogelijk maakt een snelle in-schip mixen en gelijkmatige verdeling van cellen en reagentia binnen en tussen de lagen van elk vaartuig en consequent produceren cellen die kunnen worden gekweekt in een omgeving die is congruent aan T-175 flessen.
Het ontwerp van deze Multi-Kolven maakt het ook mogelijk voor convenient pipet toegang voor het toevoegen van reagentia en cellen rechtstreeks in de kolven en efficiënt herstel van waardevolle cellen en reagentia en vermindert het risico op besmetting te wijten aan het gieten. Voor toepassingen waar het gieten wordt de voorkeur boven pipetteren, het ontwerp zorgt voor minimale residuele vloeistof retentie zo te verminderen verspilling van waardevolle cellen en reagentia.
Protocol
1. Protocol bij Multi-Kolven gebruiken voor celcultuur
- De voorbereiding van de schepen en het toevoegen celsuspensie
- Bereid de celgroei medium als dat nodig is.
- Line up Multi-Fles verticaal op zijn kant met de dop naar boven op het werkvlak (steriel laminaire flow afzuigkap).
- Deze kolven zijn verkrijgbaar in 3 en 5-layer-formaten en het gebruik van een soortgelijk werk-flow patroon als een T-175 kolf.
- Los en verwijder caps. Voeg benodigde hoeveelheid voorverwarmd medium in erlenmeyer met behulp van een 50 of 100 mL pipet of door gieten.
- Pipetten die ≤ 10 ml kan de bodem van het vat te bereiken wanneer Multi-Kolven worden verticaal geplaatst met dop naar boven. Pipetten ≥ 10 ml direct bereiken in het vat verleden het logo op de Multi-Flask, en bieden zodoende een handig portaal naar grotere volumes van de media van de schepen toe te voegen.
- Om te voorkomen dat borrelen van medium, laat vloeistofstroom naar flow langs de binnenwand van de Multi-Flask deksel (logo-side).
- Voeg celsuspensie van een geconcentreerde cel bouillon in groeimedium door de bovenste laag met behulp van een pipet van 10 ml en pet flessen.
Tips:
- Vervoer Multi-vaten aan een wagen om incubator site en uit te voeren stappen.
- De cel zaaien dichtheid zal variëren afhankelijk van het celtype, medium en cultuur duur nodig hebben. Begin met het zaaien dichtheid en de media het volume dat wordt gebruikt in standaard T-175 flessen en vermenigvuldig dat met 3 of 5, afhankelijk van de Multi-Flask formaat gebruikt.
- Het mengen van cellen
- Mix positie: Houd de Multi-Flask met het logo naar u toe en draai tegen de klok in een hoek van 45 ° met een mix poort naar u toe.
- Houden onder dezelfde hoek, zacht Multi-Flask kantelen van voor naar (de hals van je af) terug tot vloeistof in de bovenste laag riool volledig downwards door de mix heen-poort. Pivot op vermengen bakboord.
- Ook schud Multi-Flask van achter naar voren (de hals naar u toe) tot medium riolering volledig van de onderste laag naar boven door de mix heen-poort. Herhaal de stappen 1.2.2 en 1.2.3 een meer tijd om een goede menging te garanderen.
- Breng Multi-Flask terug te mengen positie (stap 1.2.1) en ga verder met stap 1.3
- Als alternatief kan celsuspensie extern worden bereid uit de Multi-kolf en celsuspensie kan worden toegevoegd aan het schip met behulp van een pipet of door zachtjes te gieten.
- Mix poort maakt het mogelijk in-vat mengen van cellen met de media en elimineert de noodzaak om extern te maken van grote hoeveelheden celsuspensies.
- Het maakt het ook mogelijk media-egalisatie over de lagen van de Multi-Flask
- Evenwicht van vocht
- Na het mengen / toevoegen van de celsuspensie, te plaatsen Multi-Fles verticaal op een vlakke werkoppervlak gelijk vloeistofvolume vergelijkingenlly in alle lagen.
- Partitie vloeistof in elke laag
- Houd de Multi-Flask met het logo naar u toe en draai met de klok mee naar een hoek van 45 ° tot afscherming van de vloeistof in elk van de lagen.
Tip:
- Voor de beste resultaten, is het belangrijk om een plat werkoppervlak te gebruiken voor Steps 1.3-1.4
- Houd de Multi-Flask met het logo naar u toe en draai met de klok mee naar een hoek van 45 ° tot afscherming van de vloeistof in elk van de lagen.
- Transport
- Zodra media met celsuspensie is gepartitioneerd, transport Multi-Flask in dezelfde hoek van 45 ° (met de klok mee), zoals in stap 1.4.1 met media uit de buurt van de mix-poort in de incubator. Deze positie is ook geschikt bij het verwijderen van kolven van de incubator voor weergave op een microscoop.
- Het plaatsen van Multi-Flask op incubator shelf
- Holding Multi-Flask op de hoek van 45 ° (met de klok mee, weg van de mix-poort), voorzichtig draai het naar beneden horizontaal op de incubator oppervlak (met behulp van de hoek uit de buurt van de mix-poort als eenpivot). Lay Multi-fles met logo naar boven.
- Falcon Multi-Flask ontwerp maakt het mogelijk schepen te stapelen en houdt ze op zijn plaats door een stevige stapelen rib.
- Holding Multi-Flask op de hoek van 45 ° (met de klok mee, weg van de mix-poort), voorzichtig draai het naar beneden horizontaal op de incubator oppervlak (met behulp van de hoek uit de buurt van de mix-poort als eenpivot). Lay Multi-fles met logo naar boven.
- Distributie van cellen en reagentia
- Na het plaatsen van Multi-Flask plat op het werkvlak, zachtjes heen en weer en side-naar rechts gelijkmatig te verdelen cellen op cultuur oppervlakken zorg dat u geen vloeistoffen gemorst van elke laag. Stack kolven.
- Deze fles is gemaakt van optisch helder materiaal en cellen op de laatste laag kan gemakkelijk worden bekeken op een microscoop.
- Na het plaatsen van Multi-Flask plat op het werkvlak, zachtjes heen en weer en side-naar rechts gelijkmatig te verdelen cellen op cultuur oppervlakken zorg dat u geen vloeistoffen gemorst van elke laag. Stack kolven.
- Media-uitwisseling
- Zuigen, terwijl het kantelen van de Multi-Flask naar links (mix port-zijde) met het logo naar u toe.
- Vervolgens tilt, de Multi-Flask naar rechts, blijven alle overblijvende media aspireren.
- Voeg juiste hoeveelheid media en volg de stappen 1.3-1.7
2.Oogsten cellen van Multi-Kolven
- Aan cellen, line-up Multi-Kolven verticaal dissociëren en brengen elk een stand (stap 1.2.1) Mix. Voorzichtig omdraaien kolven met de hals naar je toe zodat de media drain naar de bovenste laag van de Multi-Flask.
- Steek een 5 of 10 ml opzuigen tip via de nek tot je vloeistof niveau in de buurt van de mix-poort. Aspiratie uitgeput medium.
- Voeg dissociatie reagens / wasbuffer en breng aan de positie Mix zoals in stap 1.2.1, ga dan verder en volg de stappen 1.3-1.7. Neutraliseren met groeimedium / neutraliserend agent en giet celsuspensie in een ontvangende buis of omkeren fles zodanig dat cellen drain naar de bovenste laag van het vat en het verzamelen van cellen met behulp van een pipet van 10 ml.
Tip: Om herstel van cellen of reagentia te verbeteren, brengen Multi-kolf met positie (stap 1.2.1) mix, omkeren met nek naar de gebruiker om volledige afvoer van materiaal uit al laten l lagen om de bovenste laag. Dan tilt Multi-Flask de klok mee om hoek van 45 ° (weg van de mix-poort), terwijl de Multi-Flask blijft omgekeerd. Gebruik een pipet (1-10 ml) om de resterende reagentia te verzamelen.
3. Aanbevolen werkvolume in Falcon Multi-Kolven
Groeimedia
3-laag: 75 tot 150 ml per Multi-Flask
5-laag: 125 tot 250 ml per Multi-Flask
Dissociatie-agent
3-Layer: ≥ 15 ml per Multi-Flask
5-Layer: ≥ 25 ml per Multi-Flask
Tip: Begin met een gemiddelde volume gebruikt in de standaard T-175 flessen en vermenigvuldig dat met 3 of 5 keer, afhankelijk van de Multi-Flask format geëvalueerd, zodat ml per oppervlakte-eenheid blijft hetzelfde.
4. Representatieve resultaten:
1. Ontwerp van Falcon Multi-Flask
files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
. Figuur 1: Multi-Flask Cultuur van de Cel schepen zijn verkrijgbaar in een 3 - en 5-laags stapelbaar formaat voor schaal-up van cellen leveren 525 en 875 cm 2 groei van oppervlakte, respectievelijk. Pipetteer toegang vergemakkelijkt toevoeging en verwijdering van cellen en reagentia in-en uit het vat. Aanwezigheid van mix-poort zorgt voor een snelle in-vat mengen en egalisatie van de media in alle lagen van de Multi-Flask.
2. Celopbrengst met behulp van Multi-Flask:
Deze schepen zijn beschikbaar in 3-laags en 5-layer-formaten die overeenkomen met 3 en 5 maal de oppervlakte van de T-175 flessen. Dienovereenkomstig, ≥ 3 en 5 maal (130 ± 6,8 x 10 6 en 218 ± 23,6 x 10 6 cellen, respectievelijk) het aantal BHK-21 (baby hamster nier) cellen werden gekweekt en hersteld van Multi-Flask in vergelijking met T-175 kolven (43,2 ± 3,5 x 10 6 cellen, fig. 2a). Celopbrengst per unit oppervlakte was gelijk in 3 - en 5-layer Multi-Kolven en T-175 flessen voor de BHK-21, LNCaP (menselijke prostaat adenocarcinoma cellijn), Hep-G2 (menselijke levercarcinoom cellijn), EcoPack 2-293 (menselijke nier cellijn) gekweekt voor een periode van 48-96h (Fig.2B) in groeimedia (35 ml per laag), zoals aanbevolen door cel verkoper (ATCC, Sigma en / of Clontech). Cellen werden opgesomd op een geautomatiseerde Vi-CELL teller (1).
Figuur 2A: Drie en vijf keer het aantal van de BHK-21 cellen werden gekweekt en hersteld van 3 - en 5-layer Multi-Kolven in vergelijking met T-175 flessen. Verwachte opbrengst werd bepaald met behulp van gemiddelde cel opbrengst van de controle T-175 flessen, vermenigvuldigd met drie en vijf keer voor de 3 - en 5-layer Multi-Kolven respectievelijk (n = 4 kolven / formaat).
Figuur 2B: Cell opbrengst per cm 2 was gelijk in 3 - en 5-layer Multi-Kolven en T-175 flessen voor de BHK-21, LNCaP, HepG2 en EcoPack2-293 cellen. Elke staaf stelt betekenen van 4 tot 6 flessen. BHK-21 cellen (11.000 cells/cm2) werden gekweekt gedurende 72 uur, LNCaP cellen (20.000 cells/cm2) en EcoPack2-293-cellen (~ 35.000 cells/cm2) werden gekweekt gedurende 96 uur en HepG2-cellen (25.000 cellen / cm 2 ) werden gekweekt gedurende 48 uur voorafgaand aan de oogst.
3. Media verdeling lagen van Multi-Flask
Celcultuur medium (DMEM, Invitrogen) werd toegevoegd aan 5-layer Multi-Kolven (250 mL/5-layer schip) en verdeeld in lagen volgens protocol zoals hierboven beschreven. Mediadistributie werd gemeten door het boren van gaten in elke laag en media gepompt uit afzonderlijke lagen. Gewicht van de vloeistof teruggewonnen uit elke laag bleek vrij uniform zijn van laag naar laag zoals getoond in Fig 3. Ze zijn als volgt: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0.58, 50.21 ± 0.13, 49.88 ± 0.35, 49.45 ± 0.37 (gm).
Figuur 3. Uniform mediadistributie in elk van de vijf lagen van een 5-layer Multi-Flask. Celkweekmedium werd toegevoegd aan Multi-Kolven (250 ml/5-layer schip), in evenwicht gebracht en verdeeld aan individuele lagen. De media werd gepompt uit door gaten geboord in de afzonderlijke lagen en vocht gewicht was opgenomen van elke laag (n = 6 flessen).
4. Cell verdeling tussen de lagen van Multi-Flask
Cellen kunnen worden toegevoegd en gemengd in de Multi-Flask. We gesimuleerde verdeling van de cellen tussen de lagen van Multi-Flask met behulp van kralen (10μm; Polysciences Inc), vergelijkbaar in grootte aan cellen. Kraal suspensie werd toegevoegd aan Multi-Flask schip met behulp van een 10 ml pipet door de bovenste laag en gemengd met de media in het vat als aflopendribed in het protocol hierboven. Kraal distributie werd gemeten door het boren van gaten in elke laag en vloeistof met kraal suspensie werd gepompt uit afzonderlijke lagen. Bead concentratie hersteld van iedere laag werd gelezen op een Coulter Counter en geregistreerd. Hieronder weergegeven gelijkwaardig zijn inter-layer kraal distributies in 3-lagen Multi-Kolven (fig.4a). De mix-poort maakt een homogene verdeling van de cellen en reagentia tussen Multi-Flask lagen.
Figuur 4A: Bead distributie in elk van de drie lagen van een 3-laags Multi-Flask. Een suspensie van kralen (3,6 x 10 6 / ml) werd toegevoegd aan medium gedispenseerd in Multi-Kolven (bead schorsing: mediavolume is 1:10, vol: vol) en gemengd, gevolgd door evenwicht en partitie stappen met behulp van de beschreven protocol. Bead concentratie hersteld van elke laag (medium gepompt door de gaten geboord op elke laag) werd gelezen op een Coulter CountER en geregistreerd. Hieronder weergegeven gelijkwaardig zijn inter-layer kraal distributies in 3 - lagen Multi-Kolven (n = 5 flacons)
Hieronder volgt zijn representatief beeld van Ecopack 2-293 kleurpatronen van cellen uitgegroeid tot> 80% confluentie op 3-layer Multi-Kolven in groei aangevuld media. Celmonolagen werden gefixeerd en gekleurd met kristalviolet en Multi-Flask lagen werden vervolgens gesneden en afbeeldingen die zijn gescand (2). Let op, cel patroon was homogeen op alle lagen van de Multi-Kolf (Fig.4B). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met meerdere celtypen geëvalueerd (gegevens niet getoond).
Figuur 4B: Deze figuur illustreert homogene celgroei tussen de lagen van Multi-kolven. Ecopack-2-293-cellen gegroeid tot> 80% confluentie in 3-lagen Multi-Kolven en T-175 waren gefixeerd en gekleurd met kristalviolet. Multi-Flask schepen werden gesneden en elke gekleurde laag werd gescand.
5 luchttoevoer in Multi-kolf.:
Analyse van gebruikte media met BioProfile FLEX analyser (3,4) (Nova Biomedical) van EcoPack2-293 cellen gekweekt gedurende 96 uur lieten geen verschil in de lucht verzadiging van cellen gekweekt in 5-layer Multi-Kolven vs T-175 flessen (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% omgevingslicht O 2).
Figuur 5: Air verzadiging (% ambient O 2) van gebruikte media waren gelijk in de pre-mixed media van 5-layer Multi-Kolven vs T-175 flessen. EcoPack2-293 cellen werden uitgezet met een dichtheid van 35.000 cellen / cm 2 en gekweekt gedurende 96 uur voorafgaand aan de media-analyse (n = 3 flessen).
Discussie
De huidige studie toont de stijging van de productiviteit, dat de Multi-Flask ontwerp onderzoekers biedt. Hoewel het belangrijk is het volgen van de hierboven beschreven stappen voor optimale prestaties bij het gebruik van Multi-Kolven, zijn er weinig kritische stappen in dit protocol worden geacht dat de meest essentiële. Deze omvatten (i) het mengen van cellen en het gebruik van de reagentia mix haven in het vat (ii) het vervoer van Multi-Flask bij een hoek van 45 ° met de klok mee na de faseverdeling vloeistof in elk van de lagen (iii) houdende Multi-Flask vlak na de opdeling in de incubator.
Correct gebruik van Multi-Flask leidt tot de productie van een homogene cel bevolking dat in elk vaartuig dat is gekweekt in een omgeving die is congruent aan T-175 flessen (5). Deze schepen bieden 3 en 5 keer meer cellen in een soortgelijke voetafdruk als de T-175 kolf. De 3 en 5-laags schip biedt 525 en 875cm 2 van groeigebied, respectievelijk en bieden zowel ruimte en arbeid savings aan gebruikers. Tissue Culture Oppervlaktebehandeling is vergelijkbaar met de standaard kolven waardoor schaal-up zonder de noodzaak om opnieuw te optimaliseren van bestaande cultuur voorwaarden of afbreuk te doen aan de kwaliteit, homogeniteit of de prestaties van cellen (6, 7). Dit biedt ook voor de vergelijkbaarheid met eerder verzamelde gegevens. Deze schepen kunnen ook worden bekleed met reagentia, zoals collageen, fibronectine, poly-D-lysine naar een gespecialiseerde substraat voor hechting, groei en differentiatie van bepaalde celtypes, zoals hepatocyten 8, 9 kertainocytes, stamcellen gekweekt in serum-vrije media formuleringen. Coating oplossingen kunnen worden verwijderd met minimale residuele vloeistof retentie om zo verspilling van waardevolle reagentia en effectieve verwijdering van de coating-oplossing te verminderen voorafgaand aan het kweken van cellen. De aanbevolen optimale media volume aan cultuur cellen in Multi-kolven range ,142-0.287 ml / cm 2, die vertalen naar 25-50 ml per laag. In tegenstelling tot de andere lagen kolf, tzijn product biedt een mix-poort in het vat die het mogelijk maakt een snelle in-schip mixen en gelijkmatige verdeling van cellen en reagentia binnen en tussen de lagen van elk schip. Diverse cellijnen, primaire culturen en stamcellen zijn opgeschaald efficiënt gebruik van Multi-kolven. Deze schepen zijn bijzonder voordelig in toepassingen die een groot aantal cellen, zoals in high throughput-screening, de productie van vaccins, virale vector transfecties en celtherapie vraag.
Besparingen in tijd, ruimte, arbeid en een verminderde afvalproductie zijn de belangrijkste winst van de Multi-Flask versus conventionele culturen in single-gelaagde schepen. We kunnen de cultuur ongeveer drie keer het aantal cellen geoogst van 5, T-175 flessen in dezelfde ruimte met behulp van 3, 5-laags Multi-kolven. Dit voordeel in de ruimte besparen is niet alleen beperkt tot T-175, maar kan ook worden uitgebreid tot andere schepen: een standaard-roller flesje apparaat dat past in gewone laboratorium incubators huizen ~ 4 rolLER flessen (2200 ml), die elk 850cm 2 oppervlak. In hetzelfde gebied, kan ~ 20, 5-layer Multi-Kolven worden gehuisvest waardoor het verstrekken van vijf keer de groei van het oppervlak tot cultuur cellen. Bovendien, met een toename van de "Go-Green" bewustzijn, mogelijkheden om afval te verminderen is zeer wenselijk. In dat opzicht is er een 38% (5, T-175 flessen wegen ~ 640g terwijl een, 5-laags Multi-Flask weegt ~ 400 g) daling van de afvalproductie met behulp van Multi-Kolven in vergelijking met T-175 kolven en deze voordelen leiden af te nemen in de opslag van afvalstoffen en de verwijdering kosten en leiden tot economische besparingen voor de gebruiker.
Openbaarmakingen
Alle auteurs zijn medewerkers van Becton Dickinson, Biosciences Segment, Discovery Labware Unit.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van de Reagens / Equipment | Vennootschap | Catalogus # | Reacties |
| 3-laags Tissue Culture behandeld 525cm 2 | BD Biosciences | 353143 | BD Biosciences Cel Cultuur - BD Falcon Multi-Kolven |
| 5-laags Tissue Culture behandeld 875cm 2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100 ml pipet | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml pipet opzuigen | BD Biosciences | 357.501 | |
| 50 ml polypropyleen conische buis | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 fles Tissue Culture behandeld | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsine-EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Foetaal runderserum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Fosfaat Broth | Sigma | T8159 | |
| BHK-21-cellen | Sigma | 85011433 | |
| Hep-G2, LNCaP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyreen Bead | Polysciences Inc | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
Referenties
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).
- Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).
- Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).
- Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
- Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).
- Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
- Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).
- Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303-2303 (2002).
Herprints en machtigingen
