RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

Samenvatting

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie identificeren C. elegans Met behulp van een RNAi-gebaseerde genomische scherm en een geïntegreerde transgen dat een functionele, fluorescent gelabeld eiwit tot expressie brengt.

Samenvatting

C. elegans heeft zich bewezen als een waardevol model voor de ontdekking en functionele karakterisering van vele genen en pathways ^1. Meer geavanceerde tools en middelen voor studies in dit systeem zijn het vergemakkelijken van voortdurende ontdekking van de genen met meer subtiele fenotypes of rollen.

Hier presenteren we een algemeen protocol waarin we aangepast voor het identificeren van C. elegans genen met postembryonic fenotypen van belang met behulp van RNAi ^2. Deze procedure is eenvoudig aan te passen voor het testen van het fenotype van de keuze, hetzij door licht of fluorescentie optica op een dissectie of samengestelde microscoop. Deze screening protocol speelt in op de fysieke activa van het organisme en moleculaire technieken de C. elegans onderzoeksgemeenschap heeft geproduceerd. Als voorbeeld tonen we het gebruik van een geïntegreerde transgen een fluorescerend product uit in een RNAi scherm genen die voor normaal lokalisatie van deze identificatieproduct in een vergevorderd stadium larven en volwassenen. Eerst gebruikten we een commercieel verkrijgbare genomische bibliotheek met RNAi volle lengte cDNA-inserts. Deze bibliotheek vergemakkelijkt de snelle identificatie van meerdere kandidaten door RNAi vermindering van de kandidaat-genproduct. Ten tweede hebben we gegenereerd een geïntegreerde transgen dat onze fluorecently gelabeld eiwit van interesse uit in een RNAi-gevoelige achtergrond. Derde, door belichting gearceerde dieren RNAi, dit scherm kunnen herkennen genproducten die een belangrijke rol embryonale die anders zou maskeren postembryonale rol in het reguleren het eiwit van belang zijn. Tot slot, dit scherm maakt gebruik van een samengestelde microscoop uitgerust voor enkele cel resolutie.

Protocol

1. Screening stam bouw

Het zorgvuldige ontwerp van de screening stam is van cruciaal belang voor het succes van het scherm en is elders ³ beschreven. Voor sommige onderzoekers gebruikt een stam die een zichtbare product drukt een transgen nodig voor de proef. Veel stammen met geïntegreerde transgenen zijn verkrijgbaar bij de CGC of individuele onderzoekers. Als een transgene stam nodig is voor het scherm, maar niet beschikbaar is, dan kan worden opgewekt met een gepubliceerde methode zoals bombardement ⁴ UV / TMP ⁵ of Mos transposoninsertie ^6. Om onze eiwit van belang zichtbaar te maken, we door h....

Discussie

De RNAi screening methode hier gepresenteerde zorgt voor een gevoelige en snelle analyse van gen-producten die nodig zijn voor een normale (of transgene) postembryonic fenotype. Het voorbeeld is een scherm voor genen die betrokken zijn bij de subcellulaire lokalisatie van een fluorescent gelabeld eiwit. Toch kan dit protocol worden aangepast om genen die van invloed andere postembryonic fenotypen van belang vast te stellen.

Deze methode maakt gebruik van een kandidaat-gen benadering met behu.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
NGM Agar	Nematode groeimedium	IPM Scientific, Inc	Kan bereid worden met NGM agar-protocol 25
M9 Medium	22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1 mM MgSÜ4		26
Agar-agar	Merck Chemicals Inc	1.01614.1000	2% in water NGM platen. 4% in water voor microscoopglaasje pads (autoclaaf in eerste instantie en magnetron daarna te smelten).
Bacto pepton	Becton Dickinson - Difco CP	211677	0,25%
IPTG	Research Products International Corp	I56000-5.0	1 mM eindconcentratie
carbenicilline	Research Products International Corp	C46000-5.0	50 ug / ml werkverdunning
LB-bouillon Lennox	Becton Dickinson - Difco CP	240230	20 g / liter
tetracycline	Sigma	268054	12,5 ug / ml werkverdunning
natriumhypochloriet	Elk merk	5% bleekwater	Gebruik verse bleekmiddel.
natriumhydroxide	Elk merk	CAS 1310-73-2	5 N voorraad
M9 medium	Wormlab Receptenboek	http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab	26
Levamisol	Sigma	31742	100 uM - 1 mM werkverdunning
natriumazide	Fisher Scientific	S227	10 mM in M9 werkverdunning
24-wells plaat	Greiner Bio-One	662160	VWR verdeler
objectglaasjes	Elk merk	75 x 25 x 1 mm
microscoop dekglaasjes	Elk merk	22 x 22 mm No.1.5	Gebruik de dikte aanbevolen door de fabrikant microscoop.
samengestelde microscoop	Carl Zeiss, Inc	A1M	Gebruik doelstellingen en filters om de behoeften van het experiment te passen.
media-pomp	Manostaat Varistaltic pomp	Kate model # 72-620-000	Gebruik slangen en de juiste instellingen voor de machine