γ-herpesvirussen (γ-HVS) het vaststellen van een leven lang persistentie in hun gastheer. Infectie van muizen met γ-HV68 biedt een genetisch handelbaar In vivo Model voor de karakterisering van de levenscyclus / pathogenese van γHVs. Dit protocol beschrijft de detectie en kwantificering van γHV68 infectie bij acute en latente fase na infectie door plaque-forming, aanstekelijke centrum en qPCR assays.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
γ-herpesvirussen (γ-HVS) zijn bekend om hun vermogen om latente infecties van lymfoïde cellen 1 vast te stellen. De smalle gastheer bereik van het menselijk γ-HVS, zoals EBV en KSHV, ernstig heeft gehinderd gedetailleerde pathogene studies. Murine γ-herpesvirus 68 (γHV68) aandelen uitgebreide genetische en biologische overeenkomsten met menselijke γ-HVS en is een natuurlijke ziekteverwekker van murid knaagdieren 2. Als zodanig, de evaluatie van γHV68 infectie van de muizen inteeltstammen in verschillende stadia van virale infectie geeft een belangrijk model voor het begrijpen van virale levenscyclus en pathogenese tijdens γ-HVS infectie.
Na intranasale inoculatie, γHV68 infectie resulteert in een acute viremie in de longen, dat is later opgelost in een latente infectie van splenocyten en andere cellen, die kunnen worden gereactiveerd gedurende de gehele looptijd van de gastheer 3,4. In dit protocol beschrijven we hoe de plaque assay te gebruiken om te beoordelens besmettelijke virus titer in de longen homogenaten op Vero cel monolagen aan het vroege stadium (5 - 7 dagen) van het post-intranasale infectie (dpi). Terwijl de acute infectie is grotendeels geklaard 2 - 3 weken postinfection, een latente infectie van γHV68 is gevestigd rond 14 dpi en onderhouden later in de milt van de muizen. Latente infectie treft meestal een zeer kleine populatie van cellen in de geïnfecteerde weefsels, waardoor het virus blijft latent en schakelt de meeste van zijn genexpressie. Latent-geïnfecteerde splenocyten spontaan activeren virus bij explanting in weefselkweek, die kan worden samengevat door een besmettelijk centrum (IC) test aan de viral load latente bepalen. Om verder het aantal virale genoom exemplaren raming in de acute en / of latent geïnfecteerde weefsels, kwantitatieve real-time PCR (qPCR) wordt gebruikt voor de maximale gevoeligheid en nauwkeurigheid. De gecombineerde analyse van de resultaten van qPCR en plaque assay, en / of IC-test zal onthullen de spatiotemporele profielen van viralereplicatie en infectiviteit in vivo.
Protocol
Het volgende protocol beschrijft de studie van virus titers en virale genoom lasten in de lytische en latente infectie cyclus van γHV68 in muizen, die theoretisch gebruikt kunnen worden om infectie te evalueren door andere virussen die dezelfde levensstijl aan die van γHV68.
1. Versterking van γHV68
- Ontdooi een bevroren flesje γHV68 in 37 ° C waterbad.
- Voeg toe aan virale inoculums NIH3T12 of 3T3-cel-cultuur (~ 50% confluentie) in 10 cm gerechten en de cultuur van de geïnfecteerde cellen bij 37 ° C in 5% CO 2.
- Onderzoek van de cultuur door microscopie voor cytopathische effect (CPE) en het verzamelen van de media in een tijd waarin meer dan 80% van de cellen vertonen CPE 4 ~ 5 dagen na de infectie. Het maximaliseren van de opbrengst van het virus kan de geïnfecteerde celkweek twee keer ingevroren en ontdooid, aan alle cel-geassocieerde γHV68 release.
- Centrifugeer de verzamelde media bij 1000 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) aan cel puin te verwijderen.
- Breng voorzichtig de bovenstaande vloeistoffen om nieuwe buizen (high-speed centrifuge buis) zonder het aanraken van de cel puin op de bodem.
- High-speed centrifuge bij 12.000 rpm (voor Sorvall SA-600) bij 4 ° C gedurende ten minste 1,5 uur tot virale deeltjes concentreren.
- Gooi de bovenstaande vloeistoffen in 10γ bleekwater oplossing en zorgvuldig de pellet (virus en de resterende celresten) opnieuw te schorten met 1 ml serum-vrij DMEM. Breng de re-gesuspendeerde pellet in een 1,5 ml micro-centrifugebuis en meng goed door vortexen.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten op maximale snelheid om de resterende cel vuil te verwijderen en de supernatant (virus voorraad) over te dragen aan een nieuwe buis. Dit is de laatste voorraad voor virale infectie. De titer van het virus aandelen wordt bepaald door de plaque assay (zie hieronder).
2. Intranasale Infectie van Muizen met γHV68
- Infecteren muizen op ~ 6 weken oud met 1000 ~ 5000 plaque-vormende eenheden (PFU) van γHV68 per muizen.
- Verdovenmuizen door injectie van ketamine / xylazine (60 ul / muis van een mengsel van 80 mg / ml ketamine en 12 mg / ml xylazine) in buikholte. Monitor verdoving door knijpen de muizen teen. Het duurt meestal ~ 5-10 minuten. Als muizen zijn niet volledig verdoofd, zullen ze niezen het virus.
- Wanneer de muis is volledig onder narcose, gebruik dan een pipet op ~ 30 pi PBS, met γHV68 (15 ul op elk neusgat) inoculeren aan muizen drop-door-drop langzaam maar gestaag. Zorg ervoor dat de muis is inderdaad de druppels zonder te proberen om luchtbellen te vormen inhaleren.
- Laat de muis om te herstellen voor 10-15 min en het welzijn van de muizen (bv. bewustzijn, ademhaling, etc.) te controleren voordat u terug te bezorgen aan de kooi. Dieren worden dagelijks gecontroleerd op ziekte en de toereikendheid van voedsel, water en beddengoed voorwaarden. Indien klinische symptomen van ziekte, pijn of ongemak te ontwikkelen, zal routine diagnostiek naar de etiologie vast te stellen worden uitgevoerd. Dieren die meer dan 20% van hun lichaamsgewicht verliezen, zullen worden opgenomen voor een maximaal gewicht te verliezenen gedood. De uiteindelijke beslissing om euthanasie uit te voeren is ter beoordeling van de klinische dierenarts en is gemaakt na overleg met de hoofdonderzoeker.
3. Plaque Assay om het virus Titer Bepaal in acuut geïnfecteerde longen
- Infectievermogen van het virus titers worden bepaald door de vorming van plaque op monolayers van Vero-cellen.
- Vero-cellen gezaaid met 2.5x10 4 cellen / putje in 12 goed platen op de dag voor plaque assay. De cellen moet gelijkmatig worden verdeeld en de cel dichtheid zou moeten oplopen tot 30 - 40% op de dag van plaque assay.
- Bereid 0,5% (w / v) methylcellulose (MC) overlay medium (tabel 1).
- Sacrifice γHV68-geïnfecteerde muizen 5-7 dagen na intranasale infectie acute-fase-virus titers te bepalen in de longen. Voor euthanization Ketamine HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) zal worden beheerd IM gevolgd door een intraveneuze overdosis Na pentobarbital (30-50 mg / kg IP). Deze methode is goedgekeurd door tHij American Veterinary Medical Association.
- Oogst de longen en spoel tweemaal met 1 x PBS aan bloedcellen te verwijderen. Verzamel een kant van de longen in 1 ml ijskoud compleet DMEM medium en blijf op ijs. Snel bevriezen de andere kant van de longen en bewaar bij -80 ° C voor de behandeling van virale DNA-lasten in de longen door qPCR (zie hieronder).
- Gebruik een tissue homogenisator om longweefsel te homogeniseren op maximale snelheid voor een sec, vries-en dooi drie keer. Was de homogenisator met 70% ethanol bij elke stap bij het verwisselen van het monster.
- Centrifugeer het gehomogeniseerde weefsel op 3000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de supernatant en transfer naar nieuwe buizen voor plaque assay.
- Bereid seriële verdunningen (meestal van 10 ° tot 10 -8) van de long homogenaat monsters in 1,5 ml micro-centrifuge buizen met duidelijke DMEM door de vortex. Uitvullen het juiste aantal van buizen met 540 ul DMEM en verdun 60 ul homogenaat in de eerste buis. Transfer 60 ul van de eerste buis iniet de volgende, en zo verder.
- Aspireren media van de voorbereide Vero monolagen in de 12-well platen en belasting 200 ul / putje serieel verdund homogenaat met besmettelijke virussen in een omgekeerde volgorde (van 10 -8 tot 10 °). Gebruik twee putten voor iedere titratie (in tweevoud).
- Incubeer de Vero-cellen met het virus inoculums 1 uur bij 37 ° C. Zwenk de platen om de 15 minuten gelijkmatig te verdelen het virus over de monolaag.
- Verwijder de inoculums en vervang deze door 2 ml / putje van de overlay medium (tabel 1). Incubeer de platen gedurende een week bij 37 ° C.
- Verwijder de overlay medium (hoeft niet volledig te zijn) en te vervangen door de fix / vlek midden van plaque assay (tabel 1) en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wanneer de platen worden gedroogd, tel het aantal goed geïsoleerde plaques bij elke verdunning. Te minimaliseren fout, worden alleen de putjes die tussen 10 en 100 plaques geteld.
- Bereken het virus titer met behulp van de volwing formule: titer (pfu / ml) = [(aantal plaques / putje) / (volume van de inoculums / well)] x verdunningsfactor.
4. Infectieuze Center Assay om het virus Load in latent geïnfecteerde Splenocyten bepalen
- Viral latente belasting wordt bepaald door de besmettelijke centrum (IC) test op de monolaag van Vero-cellen. De dag voor IC-assay, zaad Vero-cellen in 6-well platen (1 -. 2,5 X 10 5 cellen / putje We doorgaans 11 putten per milt sample te gebruiken, 10 putten zal worden gebruikt voor het serieel verdund splenocyten schorsing en een goed voor het testen van spontane reactivering van het virus na vries-dooi cycli.
- Offer de geïnfecteerde muizen na latentie is vastgesteld (12 - 14 dagen na de infectie). Oogst de muis milt en het zwembad ze in 1 ml gekoelde DMEM.
- Mechanische dissociatie van muis-milt. Breng de vers geïsoleerde muis milt in een 10 cm bord en voeg 10 ml van de gewenste medium, zoals DMEM met 2% FBS. Wet twee matte-end glas Microscope dia's met ijs-koud medium. Plaats de milt aan de matte kant van een dia en nick de capsule met de rand van de mat einde van de andere dia. Mechanisch scheiden de milt tussen twee dia's totdat alle rode klompjes worden verpletterd (ook vet te verwijderen deeltjes indien aanwezig).
- Spoel de objectglaasjes met DMEM om de resterende cellen op beide dia's terug te krijgen.
- Voorzichtig Breng de hele weefsel suspensie via een mobiele zeef (40 um nylon mesh) in een 50 ml conische schroef-cap tube. Was de 10 cm schotel met daarin de milt homogenaten met 10 ml PBS en breng tijdens het filteren.
- Centrifugeer de single celsuspensies 10 min bij 375 xg en gooi supernatant. Flick de cel pellets te breken bestaande cel klonten. Voeg 5 ml ACK buffer (tabel 1) om de rode bloedcellen lyseren. Incubeer 5 min en centrifugeer weer op 375 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets, grondig, maar voorzichtig, in PBS met 2% FBS. Houden cellen bij 4 ° C. Gebruik een pipetverwijderen vuil, indien aanwezig. Count levensvatbare cellen met behulp van een automatische celgetalmeter (Bio-Rad).
- Spin down van de PBS-geresuspendeerd splenocyten op 375 xg gedurende 4 minuten. Gooi supernatant en resuspendeer de cellen in 4 ml DMEM compleet (2 x 1 ml zal worden gebruikt voor de IC-test van de oorspronkelijke schorsing; 0,6 ml wordt gebruikt voor seriële vijf-voudige verdunning in IC-assay, 0,4 ml voor virale DNA voorbereiding en qPCR, en 1 ml suspensie zal gebruikt worden om spontane reactivering van het latente virus te evalueren na drie vries-dooi cycli)
- Bereid serial vijf-voudige verdunningen (dat wil zeggen 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) van splenocyten suspensie in duplicaten. Uitvullen de 15 ml conische buizen met 2,4 ml DMEM en verdun 600 ul splenocyten suspensie in de eerste buis en meng goed. Transfer 600 ul van de vorige buis in de volgende buis, enz. Niet vortex!
- Zuig het medium van de voorbereide 6-well monolaag van Vero-cellen. Zaad 1 ml van de serieel verdunde splenocyten op Vero-cellen met elke verdunning duplicated (10 putten zal worden gebruikt voor 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 verdunningen).
- Incubeer de platen 8-12 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. Niet meer dan 24 uur. Zuig het geplaatste splenocyten vering en de belasting 4 ml overlay media (tabel 1) aan elk putje. Incubeer voor een extra 6 dagen.
- Bepaal de niveaus van de milt besmettelijke centra door kleuring van de platen met 0,2% (w / v) kristalviolet zoals weergegeven in plaque assay.
5. Kwantificering van het virale genoom
- Extract totaal genomisch DNA van de γHV68-geïnfecteerde weefsels, zoals longen en milt monsters in dit experiment. Gebruik de DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), volgende protocol van de fabrikant.
- Bepaal de DNA-concentratie van elk monster om dezelfde hoeveelheid DNA wordt gebruikt voor qPCR test te verzekeren. Het ontwerp van de virus-specifieke primers (~ 200 bp amplicon is de voorkeur voor een qPCR assay). We gebruikten de γHV68 ORF56-specifieke primers (voorwaartse primer: 5 & prime, - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; reverse primer: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') voor deze test en β-actine primers (voorwaartse primer: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'reverse primer: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') als een controle voor de qPCR reactie.
- Meng het DNA-monster (100 - 500 ng is goed) en geschikte primers met 2 x SYBR master mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Gebruik maken van de Bio-Rad Real-time PCR-systeem om de viral load in het geïnfecteerde weefsel te kwantificeren. Voer PCR op de volgende voorwaarde: 95 ° C gedurende 15 min en 45 cycli van 95 ° C gedurende 30 min, 60 ° C gedurende 30 min, en 72 ° C gedurende 30 min, gevolgd door smeltcurve analyses, voor zowel de virale en actine amplicons.
- Om een standaard curve voor de kwantificering van virale genomen te maken, in serie te verdunnen bekende hoeveelheden van een γHV68 bacmide DNA met het genomisch DNA geïsoleerd uit niet-geïnfecteerde cellen. Lopen qPCR in parallel met de DNA's opgehaald uit de infectieted weefsels met behulp van dezelfde sets van virus-specifieke primers.
- Presenteer de virale genoom belasting in de weefsels als virale DNA copy number per eenheid (bijvoorbeeld 100 ng of 500 ng) van genomisch DNA na actine normalisatie.
6. Representatieve resultaten:
Figuur 1 toont de algehele opzet van de experimenten voor het meten van γHV68 infectie bij muizen in vivo. Representatieve resultaten van het virus titers in de longen tijdens de acute infectie van γHV68, zoals bepaald door plaque assay werden getoond in Figuur 2A. Een mutante stam van γHV68 met niet-functionele virale Bcl-2 (vBcl-2) gerepliceerd op een niveau vergelijkbaar met wild-type γHV68 in de longen na 7 dagen intranasale infectie van BALB / c muizen (6 - 7 muizen per groep). Geen statistisch significante verschillen in de longen titers van het virus werden ontdekt tussen de twee groepen. Deze gegevens blijkt dat vBcl-2 niet is een cruciale factor voor de acute infectie van γHV68 inmuizen. Echter, na 28 dagen postinfection, de titer van vBcl-2 mutant virus in de milt daalde 6 - tot 10 - voudige in vergelijking met de WT, zoals gemeten door besmettelijke centrum assay (figuur 2B), wat suggereert dat de vBcl-2 mutant γHV68 virus defect is in het onderhoud van de milt latency na infectie. In overleg met de verminderde besmettelijke centrum titers, was het virale genoom belasting van de vBcl-2 mutant virus sterk verminderd in vergelijking met die van WT virussen op dag 28 in herhaalde experimenten, zoals weergegeven in figuur 2C. De nauwe correlatie tussen de virale genoom lasten en de frequentie van de latente-HV68vBcl-2 mutant virus reactivatie ex vivo in latente stadium van de infectie wijst op een vertraging defect van deze mutant virus infectie.
Figuur 1. Schematische weergave voor het meten van γHV68 infectie bij muizen door middel van plaquevorming, besmettelijke centrum en qPCR assays.
Figuur 2. Lytische en latente infectie van de WT en mutant γHV68 virussen in vivo. Acute replicatie (A) van de WT en mutant vBcl-2 γHV68 virussen in de longen van de BALB / c muizen op 7 dpi (dagen na besmetting) werd bepaald door plaque assay. (B en C) milt besmettelijke centra (B) en virale genoom belasting (C) in de milt van geïnfecteerde muizen werden gemeten bij 28 dpi door infectieuze centrum assay en qPCR, respectievelijk. Rode lijnen, de gemiddelden van de aangegeven waarden. ns, niet significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
γHV68 is op grote schaal gebruikt als een model om de pathogenese van de menselijke γ-HVS 2,4,5 te begrijpen. In dit protocol beschreven we drie routinematig gebruikte methoden, waaronder plaque assay voor besmettelijke virus titer, IC-test voor latente viral load, en qPCR voor virale genoom belasting, om de acute en latente infectie van γHV68 te evalueren na intranasale inoculatie bij muizen.
De plaque assay wordt veelvuldig gebruikt om het virus titer in geïnfecteerde cellen of ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag aan de technische advisering en ondersteuning van Ren zon (University of California, Los Angeles) en Seungmin Hwang (Washington University) te erkennen. Dit werk werd gefinancierd door de Stichting Baxter, National Institutes of Health subsidies (R01 CA140964 en R21 AI083841 naar C. Liang).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materiaal Naam | Voorbereiding Procedure | ||
| Methylcellulose (MC) overlay medium voor virale plaque assay |
| ||
| Fix / beits medium voor plaque assay | 0.2% (w / v) kristalviolet in 20% ethanol. | ||
| ACK Lysis Buffer | NH 4 Cl 0,15 M, KHCO 3 10mm, EDTA 0,1 mm | ||
| Compleet DMEM | Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium(DMEM) aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS, Invitrogen), 2 mM L-glutamine, en 1% penicilline-streptomycine (Gibco-BRL). |
Tabel 1. Specifieke media gebruikt in dit protocol
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogus nummer |
|---|---|---|
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cel zeef | BD Faclon | 352340 |
| Omni weefsel homogenisator | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR-systeem | Bio-Rad | 184-5072 |
| Celgetalmeter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Tabel 2. Specifieke reagentia en apparatuur
Referenties
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
