Immunocytochemische identificatie van perifere sensorische zenuwvezel subtypes (en de detectie van eiwit expressie daarin) zijn de sleutel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan perifere sensatie. Hier beschrijven we methoden voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters, zoals huid en ledematen botten, voor specifieke immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Detectie en de primaire verwerking van fysische, chemische en thermische zintuiglijke prikkels door perifere sensorische zenuwvezels is de sleutel tot zintuiglijke waarneming bij dieren en mensen. Deze perifere sensorische zenuwvezels drukken een overvloed aan receptoren en ionkanaal eiwitten die op te sporen en aanzet geven tot specifieke zintuiglijke prikkels. Methoden beschikbaar om de elektrische eigenschappen van perifere sensorische zenuwvezels innerveren de huid, die ook kan worden gebruikt om de functionele expressie van specifieke ion kanaal eiwitten in deze vezels te identificeren karakteriseren. Echter, soortgelijke elektrofysiologische methoden zijn niet beschikbaar (en zijn ook moeilijk te ontwikkelen) voor de detectie van de functionele expressie van receptoren en ionkanaal eiwitten in de perifere sensorische zenuwvezels innerveren andere inwendige organen, inclusief de meest uitdagende weefsels, zoals bot. Bovendien kan een dergelijke elektrofysiologische methoden niet worden gebruikt om de expressie van niet-opgewonden eiwit te bepalens in de perifere sensorische zenuwvezels. Daarom, immunokleuring van perifere / viscerale weefselmonsters voor sensorische zenuw fivers biedt de best mogelijke manier om de expressie van specifieke eiwitten van belang in deze zenuwvezels te bepalen. Tot nu toe hebben de meeste van de eiwitexpressie studies in sensorische neuronen gebruikt immunokleuring procedures in sensorische ganglia, waar de informatie wordt beperkt tot de expressie van specifieke eiwitten in de cel lichaam van specifieke soorten of subsets van sensorische neuronen. Hier hebben we rapport gedetailleerde methoden / protocollen voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters voor immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels. We specifiek detail methoden voor de voorbereiding van de huid of plantaire punch biopsie en been (femur) secties van muizen voor immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels. Deze methoden zijn niet alleen essentieel voor de kwalitatieve bepaling van eiwitexpressie in de perifere sensorische neuronen, maar bieden ook een kwantitatieve bepalingsmethode voor dehet bepalen van veranderingen in eiwit expressie niveaus in bepaalde soorten of subsets van sensorische vezels, alsmede voor het bepalen van de morfologische en / of anatomische veranderingen in het aantal en de dichtheid van sensorische vezels tijdens verschillende pathologische toestanden. Verder zijn deze methoden niet beperkt tot de kleuring van enige zintuiglijke zenuwvezels, maar kan ook worden gebruikt voor het kleuren alle soorten zenuwvezels in de huid, botten en andere viscerale weefsel.
Protocol
1. Animal Perfusie
Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa, en volg de NIH richtlijnen voor het gebruik van dieren in het onderzoek.
- Op de dag voor perfusie, bereiden een L van fosfaatbuffer (0,2 M PB in dubbel gedistilleerd H 2 O, pH 7,4), en bewaar bij 4 ° C. Deze zal worden gebruikt voor perfusie en post-fixatie processen.
- Op de dag van perfusie, voor te bereiden 500 ml van 4,0% paraformaldehyde in 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) fixatief oplossing, een volume voldoende voor de doorbloeding van twee mui....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier hebben we gedetailleerd de methodes voor de voorbereiding van de huid van muizen en botweefsel secties voor immunokleuring en detectie van perifere sensorische zenuwvezels. De secties uit plantaire stansbiopsieën bevatten zowel kaal en behaarde huid, wat betekent dat het protocol dat gebruikt kan worden op elk huidtype. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt om andere soorten cellen vlek in deze weefsels (bijv. leukocyten, vasculaire endotheel, glad spierweefsel onder andere). Deze methoden zorgen voor een uits.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken dr. M. Yuriy Usachev voor zijn hulp bij de eerste standaardisatie van confocale microscopie / beeldvorming van de muis plantaire punch biopsie immunokleuring, en Dr Donna L. Hammond voor haar voortdurende hulp en opbouwende kritiek in dit werk. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van het NINDS / NIH (NS069898), en een idee-ontwikkeling Grant Award van het ministerie van Defensie Prostaatkanker Research Program (DoD-PCRP-101096) om DPM
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Materiaal Naam | Type | Vennootschap | Catalogus Nee. | Commentaar |
| 3mm Harris Micro-Punch | Materiaal | Ted Pella | 15094 | |
| Perfusie pomp | Materiaal | VWR International | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagens | Fisher Scientific | T353 | |
| Pikrinezuur | Reagens | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| Oktober Embedding compound | Reagens | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogene spuitbus | Materiaal | Controle Bedrijf | 3118 | |
| Geit Serum | Reagens | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubatie tray en deksel voor Immunokleuring (Large) | Materiaal | RPI Corp | 248270 (lade) 248270-A (deksel) | |
| ImmEdge hydrofobe barrière pen | Materiaal | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel's Hair Borstels (# 1 dikte) | Materiaal | Ted Pella | 11859 | |
| Pro-Long Gold Montage medium | Reagens | Invitrogen | P36930 |
Referenties
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
