Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

Summary

In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.

Abstract

Het genereren en detectie van mechanische krachten is een alomtegenwoordig aspect van de cel fysiologie, met directe relevantie voor kanker metastase ^{1, 2} en atherogenese wondgenezing ^3. In elk van deze voorbeelden cellen zowel uitoefenen van kracht op de omgeving en tegelijkertijd enzymatisch vorm van de extracellulaire matrix (ECM). Het effect van krachten op ECM is zo uitgegroeid tot een gebied van groot belang vanwege de mogelijke biologische en medische belang ^4-7.

Enkel molecuul technieken zoals optische trapping ^8, atomic force microscopie ^9, en magnetische pincet ^10,11 kunnen de onderzoekers om de functie van enzymen op moleculair niveau door het uitoefenen van krachten op afzonderlijke eiwitten te onderzoeken. Van deze technieken, magnetische pincet (MT) zijn opmerkelijk vanwege hun lage kosten en hoge doorvoer. MT oefenen krachten in het bereik van 1-100 ~ pN en kunnen milliseconde temporele resolutiekwaliteiten die goed zijn voor de studie van enzym-mechanisme afgestemd op de single-molecule level ^12. Hier rapporteren een zeer parallelizable MT assay het effect van kracht op de Proteolyse van een eiwitmoleculen bestuderen. Wij geven het specifieke voorbeeld van de Proteolyse van een trimere collageen peptide matrix metalloproteinase 1 (MMP-1), maar deze assay kan gemakkelijk worden aangepast aan andere substraten en proteasen bestuderen.

Protocol

1. Flow Cell Bereiding

1. Dekglaasjes (# 1.5, 22x22 mm en 22x40 mm, VWR) worden gereinigd met ultrasoonapparaat.
   1. Voeg de dekglaasjes tot een klein glazen fles kunnen houden dekglaasjes en passend in de ultrasoonapparaat (zie stap 2).
   2. Vul de container met isopropanol en ultrasone trillingen in een bad ultrasoonapparaat gedurende 20 minuten.
   3. Gooi de isopropanol en spoel de dekglaasjes met een ruime hoeveelheid gedemineraliseerd water geproduceerd door een Barnsted MilliQ apparaat of soortgelijk apparaat. Vul de bak met water en ultrasone trillingen gedurende 20 minuten.
   4. Na sonicatie, drogen de dekglaasjes in een stroom van gefilterde, stofvrije lucht. Gebruik alleen dekglaasjes die verschijnen schoon (dwz geen vlekken).
   5. Voorzichtig vlam de dekglaasjes voor een paar seconden om ze schoon te maken van de overige stof en vocht: langs de dekglaasjes door middel van een gasvlam geproduceerd met een bunsenbrander, zorg ervoor dat u het dekglaasje als gevolg van overtollige warmte kromtrekken. Deze stap verwijdert op het oppervlakverontreinigingen.
2. Met behulp van dubbelzijdig plakband, samen bevestig de twee dekglaasjes. Snijd de tape ~ 3 cm lengte en 0,3 cm in de breedte. Bevestig de tape op 22x40 mm dekglaasje aan het verlaten van een 1,6 cm-kanaal in het midden. Gebruik een pipet tip om zachtjes in te drukken op het dekglaasje om ervoor te zorgen dat de tape goed heeft gehandeld.

2. Magnetisch pincet Setup en kalibratie

1. Magnetisch pincet waren setup met permanente zeldzame aardmetalen magneten zoals eerder beschreven ^10,12. Een aluminium L-vormige beugel is uitgevoerd met een 1 mm diameter pinhole en gemonteerd op een verticaal z-translator (Thorlabs) het moduleren van de hoogte van de pincet. Twee vaste zeldzame aardmetalen magneten zijn bevestigd aan de beugel aan weerszijden van het gaatje de magnetische trap (figuur 1) te maken.
2. DNA preparaat: DNA van faag lambda gelabeld aan de 5 'en 3' uiteinden met biotine en digoxigenine (IDT DNA, San Diego, CA) werd gebruikt om de mag kalibrerenmagnetische pincet.
   1. Meng 50 pi 4 λ nM-DNA met 2 pi van 40 nM biotine geconjugeerd oligonucleotide en warmte bij 60 ° C gedurende 10 minuten. Dan langzaam afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   2. Voeg DNA ligase volgens fabrikant en ligeren bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
   3. Voeg 2 pi van 400 nM digoxigenine geconjugeerd oligonucleotide en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
   4. Voeg 1,5 ul 10 mM ATP en verder ligatie van de digoxigenine geconjugeerde oligonucleotide de λ-DNA gedurende 3 uur.
   5. Het overtollige oligonucleotiden en DNA ligase met 100 kDa rotatie filters (Microcon Ultracell YM-100). Een totaal van 1000-voudige buffer-uitwisseling in TE-buffer is voldoende om het overtollige oligo's. Let op: Het is belangrijk niet te gebruiken centrifugetoerental> 500xG, omdat dit zal leiden tot het scheren van het DNA.
   6. Een steekproef van de DNA via elektroforese op een 0,7% agarosegel dat de DNA iis niet gedenatureerd of geschoren.
   7. Meet concentratie van DNA. Het gebruik van een NanoDrop UV-Vis spectrometer (Thermo Scientific) wordt aanbevolen omdat de beschikbare monstervolume kan zeer klein.
3. Bereid stroom cellen zoals beschreven in paragraaf 1.
4. Voor de bevestiging van de DNA van de doorstroomcel toevoegen anti-digoxigenine antilichaam (schapen IgG, 1 pg ^ml'1, Roche Bioscience, Manheim, Duitsland) en laat het op het glasoppervlak hechten gedurende 15 minuten.
5. Passiveren het oppervlak van de doorstroomcel niet-specifieke kleven van DNA voorkomen door toevoeging van 2 mg ml ^-1 BSA, 0,1% Tween-20 in PBS 1x. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
6. Herhaal stap 2.5.
7. Voeg 50 pM van fuctionalized λ-DNA en laat het dekglaasje hechten gedurende 15 minuten.
8. Verwijder de overmaat DNA met 1x PBS.
9. Voeg streptavidine gecoate parels superparamagnetische (1 pm korrels = 2 ug ^ml'1; 2,8 pm kralen = 20 pg ^ml'1 ) en laat ze aan het geïmmobiliseerde DNA hechten gedurende 15 minuten.
10. Verwijder de overmaat kralen met 1x PBS.
11. Magnetisch pincet Kalibratie
    1. Beweeg de permanente magneten in een positie die ver van het monster oppervlak (> 15 mm).
    2. Plaats bereide doorstroomcel in de microscoop.
    3. Zet de permanente magneten in positie boven de doorstroomcel.
    4. Kies het brandvlak van λ-DNA-gefunctionaliseerde kralen door te focussen op de kralen uit de buurt van beide glazen oppervlakken. De juiste focal plane is er een waarin de gewenste kralen hebben een helder centrum.
    5. Neem een ​​video van kraal beweging bij 80 Hz of meer voor de 500 frames.
    6. Plaats de magneet dichter bij het monster oppervlak. Voor afstanden boven de 5 mm, bewegen in stappen van 1 mm. Voor afstanden tussen de 1 en 5 mm, bewegen in stappen van 0,5 mm. Voor afstanden minder dan 1 mm, bewegen in stappen van 0,25 mm.
    7. Herhaal stap 2.11.5 en 2.11.6 bij elke nieuwe positie van de magneet.
    8. Voor elke dataingesteld volgen het midden van de korrels met een 2D Gaussiaanse benadering.
    9. Bereken de kracht via de Brownse fluctuaties met behulp van:

    
    waarbij k _B T de Boltzmann thermische energie, L de lengte van λ-DNA en 2> de variatie in zwaartepunt positie.

    10. De juistheid van de krachten door het controleren van de berekening van krachten via een vermogensspectrum Lorentz geschikt om de rolloff frequentie te vinden. Uitgeoefende kracht is gerelateerd aan de frequentie rolloff door de relatie:

    
    Wanneer ƒ ₀ het rolloff frequentie, een de kraal radius en μ de viscositeit ^12.

3. Collageen Peptide Bijlage bij Flow cellen

Om een ​​concreet voorbeeld voor de toepassing van onze methodologie te bieden, beschrijven we recent werk in ons laboratorium dat de proteolyse van een trimere collageen model peptide kenmerkt. We verwachten dat deze algemene benadering kan breed worden toegepast op andere eiwitten en polynucleotiden.

1. Het collageen model peptide bestaat uit een N-terminaal 6x His-tag voor zuivering, gevolgd door een 5 x Myc-label (GPP) ₁₀ drievoudige helix-formatie te handhaven, het collageen α1 residuen 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL) in de vorm MMP- een herkenningsplaats de foldon sequentie (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) en een C-terminale KKCK vergemakkelijking labelen met biotine-maleïmide. Foldon afgeleid van de T4-faag eiwit fibritin en stabiliseert collageen model trimeren bij gefuseerd aan de N - of C-terminus ^13,14.
2. Het collageen peptide en MMP-1 eiwitten werden tot expressie gebracht en gezuiverd als eerder beschreven ^4,15.
3. Voeg anti-myc (15 ug ^ml-1) tot de meetcel en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de anti-myc te hechten aan het oppervlak van de doorstroomcel.
4. Passiveren de doorstroomcel niet-specifieke bevestiging van eiwitten met 5 mg BSA ^ml'1 op dezelfde wijze als beschreven in stap 2.5 voorkomen.
5. Voeg 150 pM collageen peptide en laat het aan het antilichaam hechten via de myc-tag voor 45 minuten.
6. Verwijder de overmaat collageen met PBS-buffer.
7. Voeg streptavidine gecoate superparamagnetische kralen (1 micrometer = kralen 2 ug ^ml-1 en 2,8 micrometer kralen = 20 ug ml ^-1) en laat ze hechten aan de collageen moleculen gedurende 45 minuten. De 1 pm korrels worden verdund tot de gewenste concentratie in PBS. De 3 urn korrels te scheiden van de oplossing met sterke magneten dan resolubilized in PBS. Dit proces wordt herhaald 3 keer. We hebben gemerkt dat deze stap is essentieel voor get de 3 urn korrels te binden aan het oppervlak geïmmobiliseerd collageen peptide.

4. Force Proteolyse Assay

1. Zodra de stroom cel wordt gemonteerd met collageen peptide en magnetische korrels, het imago van de stroom cel in de magnetische val onder lage, ~ 1 pN kracht. In onze ervaring is een subpopulatie van de korrels soms zwak hechtten aan het oppervlak in een niet-specifieke wijze. De toepassing van bescheiden kracht zorgt ervoor dat deze kralen bevrijd zijn.
2. Voeg geactiveerd enzym de doorstroomcel. In dit geval MMP-1 werd vooraf geactiveerd door toevoeging 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetaat) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur. De activering werd gecontroleerd met behulp van SDS-PAGE.
3. Zodra de stroom cel wordt teruggeleid in de magnetische pincet apparaat, een video spanning enkele gezichtsveld, meestal waarbij honderden bijgevoegde kralen. Dit zal t = 0.
4. Herhaal hetzelfde proces betreffende het opslaan van verschillende gezichtsveld (terwijl t weero hetzelfde gezichtsveld) op regelmatige tijdstippen, tot alle korrels los te koppelen of geen verdere proteolyse waarneembaar is.
5. Kinetische data-analyse
   1. Tel de kralen in de verschillende domeinen van uitzicht op verschillende tijdstippen en gemiddeld hen. Normaliseren aantal korrels door de gemiddelde aantal korrels op elk tijdstip het aantal korrels bij t = 0. Dit zorgt ervoor dat we de tarieven van de proteolyse van verschillende experimenten te vergelijken, omdat het absolute aantal kralen zal verschillen van experiment om te experimenteren.
   2. Zet de verhouding als functie van de tijd. In dit geval verdient gemonteerd aan een exponentieel plus een constante.

   
   waarbij ƒ (t) is de verhouding van de korrels bevestigd (of collageenmoleculen unproteolyzed) t de tijd, a de fractie van korrels gemonteerd door collageen ketting, b is het verval constant en cde fractie korrels die niet specifiek verbonden.

   3. Hetzelfde experiment wordt herhaald bij verschillende kracht en MMP-1 concentraties om het effect van werking op collageen proteolyse verduidelijken van MMP-1.

5. Representatieve resultaten

De bovenstaande protocol beschrijft een nieuwe toepassing van magnetische pincet (figuur 1) voor het bestuderen van het effect van werking van enzymatische proteolyse. We gekalibreerd pincet 1 pm en 3 pm kralen met zowel de omvang van de waargenomen Brownse fluctuaties en berekening van de roll-off frequentie verschillende posities magneet (figuur 2). In de kracht proteolyse experimenten de installatie is gelijk behalve dat het DNA wordt vervangen collageen (figuren 3, 4). De genormaliseerde aantal korrels nog worden uitgezet als functie van de tijd de Proteolyse percentages (figuur 5) te vinden, en dit proces kanherhaald voor verschillende enzymconcentraties en krachten.

Figuur 1. Schematische weergave van de magnetische val kalibratie (niet op schaal). Twee permanente zeldzame aarde magneten zorgen voor een magnetisch veld dat trekt aan de superparamagnetische kraal. Het vertalen van de magneet op en neer past de uitgeoefende kracht. De kralen worden afgebeeld met behulp van een conventionele bright-field microscoop met het licht dat door een gaatje tussen de twee magneten Inzet:. Foto gemaakt met een 40x lucht doelstelling. De scherpe ronde punten overeen met de korrels aan het dekglaasje oppervlak. De out-of-focus objecten zijn vrijstaande kralen.

Figuur 2. Stukken de gekalibreerde kracht als functie van magneet afstand van het monster oppervlak van 1 mm (links) en 2,8 pm (rechts) beads. De gegevens werden bevestigd aan de empirische functie , Waarbij x de afstand van de magneet. A = 31,8, b = 5,61 en c = 4,39 voor 1 pm kralen en a = 140 b = 3,10 en c = 1,86 voor de 3 pm kralen. Deze waarden zijn specifiek voor onze specifieke instrument en experimentele geometrie en elk instrument moet individueel worden gekalibreerd. De foutmarges in elk punt vertegenwoordigen ~ 10% variabiliteit uitgeoefende kracht op een kraal naar hiel basis als gevolg van de variabiliteit in korrelgrootte. De toegepaste kracht is evenredig met de hoeveelheid van de korrels en de kraal volume varieert ~ 9% over het gemiddelde (volgens de specificaties).

Figuur 3. Force proteolyse test setup (niet op schaal). Het collageen model trimeer is aan het oppervlak van het dekglaasje via myc / anti-myc conjugatie. De streptavidine gecoate parels superparamagnetische zijn aan het collageen trimeren via een biotine-streptavidine koppeling. Actief MMP-1 snijdt het collageen in de tijd, waardoor de kralen op los te maken van het oppervlak en af ​​te stappen van het brandvlak.

Figuur 4. Schematische tekening van Proteolyse als functie van de tijd. De cartoon toont een voorbeeld gezichtsveld in de tijd als proteolyse optreedt. Na verloop van tijd, MMP-1 snijdt collageen en de kralen verwijderen en verder van het brandvlak onder invloed van het magnetische veld.

Figuur 5. Proteolyse tarieven zijn afhankelijk van de toegepaste kracht ^16. Getoond zijn gegevens verzameld bij 1,0 pN (3 uM MMP-1, zwart), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rood) en 13 pN (0,2 uM MMP-1; magenta). De tarieven van proteolyse (fit parameters) zijn: 0,22 ± 0,02 min ^-1 (1 PN), 0,46 ± 0,09 min ^-1 (6,2 PN), en 2,08 ± 0,18 min ^-1 (13 PN). De fractie van kralen unproteolyzed op lange tijd de punten (> 15 minuten) ongeveer constant blijft op ~ 0,25 in de verschillende experimenten. Error bars komen overeen met de Poisson statistieken als gevolg van het aantal waarnemingen op elk tijdstip. De fout op elk tijdstip van n korrels n ^1/2. De fout in de fractie van de bijgevoegde kralen werd berekend door fout propagation.1 um kralen werden gebruikt voor de 1.0 en 6.2 pN pN experimenten en 2,8 micrometer kralen werden gebruikt voor 13 pN experimenten.

Discussion

Dit protocol beschrijft een nieuwe toepassing voor een klassieke single molecule techniek. Magnetisch pincet laten medium tot high-throughput enkel molecuul testen op een kosten-efficiënte manier. Echter, net als alle andere experimentele technieken zijn er uitdagingen en mogelijke valkuilen.

Beperkingen van magnetische pincet

In vergelijking met een optische val van de ruimtelijke en temporele resolutie van een MT apparaat is laag. Bovendien is de krachten opgewekt...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer
Micro Dekglas # 1.5 (22x22)	VWR	48366-067
Micro Dekglas # 1.5 (22x40)	VWR	48393-048
Lambda DNA	Invitrogen	25250-010
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224-041
Microcontroller Ultracel YM-100	Millipore	42413
Anti-Digoxigenine	Roche Diagnostics	11-333-089-001
Tween 20	Sigma	P9416-100ML
Anti-myc antilichaam	Invitrogen	46-0603
Bovine serum albumine	Sigma	B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptavidine	Invitrogen	658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidine	Invitrogen	658.01D
p-acetaat Aminophenylmercuric	Calbiochem	164610
Biotine-maleïmide	Sigma Aldrich	B1267
Biotine gelabelde oligo	IDT DNA	Synthese op maat
Digoxigenine gelabelde oligo	IDT DNA	Synthese op maat
Collageenpeptide gen	DNA-2.0	Synthese op maat
MMP-1 cDNA	Harvard Plasmide Database
z-translator	Thorlabs	MTS50
Servo-controller voor vertaler	Thorlabs	TDC001