$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Zaaien van de cellen
- Voordat u begint, warm-up de cultuur medium, de PBS 1X en de trypsine in een waterbad bij 37 ˚ C
- Neem de cellen uit de incubator en zuig het medium.
- Voorzichtig toe te passen 5 ml PBS 1X op de cellen om ze te wassen.
- Zuig het PBS 1X en breng 1 ml trypsine bevat 0,025% EDTA.
- Voorzichtig draaien de plaat een gelijkmatige verdeling van het trypsine te hebben.
- Plaats de cellen in de incubator bij 37 ˚ C gedurende 5-10 minuten (afhankelijk van het celtype). Van tijd tot tijd te controleren of cellen worden losgemaakt door schudden van de plaat.
- Resuspendeer de cellen in 10-20 ml medium en verzamel ze in een 50 ml Falcon buis.
- Tel de cellen met behulp van een Beekman teller. Het aantal cellen moet voldoende zijn om een samenloop van ongeveer 60-70% te garanderen.
- Het bord van de cellen en laat ze zaad voor 6-8 uur.
2. TransFection
- Voorafgaand aan transfectie, warm-up een portie van serum-vrij medium in een waterbad van 37 ˚ C.
- Breng de X-treme Gene 9 tot kamertemperatuur.
- Pipet het serum vrij medium in 2 eppendorf tubes (1 tube = 1 transfectie).
- Pipet de X-treme Gene 9 in het serum vrij medium opletten dat de tip niet de plastic wand van de Eppendorf en incubeer gevoel voor 5 minuten. In de tussentijd bereiden twee DNA-mixen: in de ene buis mix samen de plasmiden voor renilla, vuurvlieg en een lege vector controle, in een andere buis renilla, vuurvlieg en de moleculaire chaperonne.
- Voeg de DNA-mix om elk eppendorf serum bevat dat vrij medium + X-treme Gene 9, vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Voeg druppelsgewijs elke mix op elk bord en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2
3. Het splitsen van de cellen
- 24 uur na transfectie, trypsinize de cellen, zoals beschreven in 1,4 tot 1,6 en verdun ze tot een definitieve confluentie van 60-70% in een 6-wells plaat.
- Bereid een plaat voor de niet-geschokt-controle en evenveel platen als de hersteltijd punten die moeten worden geanalyseerd, zoals bleek in Fig. 2.
4. Heat shock
- Voor warmte shock, pre-warm serum bevattend medium in een waterbad van 37 ˚ C.
- Voor te bereiden 'heat shock buffer' door verdunning in serum bevattend medium cycloheximide tot een uiteindelijke concentratie van 20 pg / ml en MOPS tot 20 mm.
- Nu nemen de platen uit de incubator en zuig het medium.
- Voeg toe aan elk putje 1 mL van 'Heat shock buffer', en gedurende 30 minuten bij 37 incubeer ˚ C en 5% van de CO 2 (onder meer ook de verwijzing plaat in deze behandeling). Dit zal de novo eiwitsynthese te stoppen.
- In de tussentijd schakelaar op een waterbad en zet de temperature bij 45 ˚ C.
- Na de incubatie zegel het deksel van de platen met Parafilm eerder gesneden in strepen. De referentie-plaat (100% van refolfed vuurvliegje) is nog in de couveuse.
- Incubeer de platen bij 45 ˚ C gedurende 30 minuten.
- Verwijder de platen uit het waterbad, verwijder de parafilm en weer de platen om de couveuse naar herstel mogelijk te maken.
- Op elk tijdstip de oogst van de cellen en was ze in PBS 1x door centrifugeren bij 2000Xg gedurende 1 minuut bij 4 ˚ C.
5. Cellysis en luciferase assay
- Voor een efficiënte cellysis, snap bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof.
- Voeg 200 ul van passieve lysis buffer verdund 1:05 in dubbel gedistilleerd water in een glazen buis.
- Voeg 30 ul van de cel lysaat in een 96 wells plaat. Elk monster wordt gepipetteerd in drievoud.
- Alleen de 'niet geschrokken' referentiemonsters worden gebruikt omLees de renilla luciferase-activiteit, omdat deze stap wordt gebruikt om gelijk transfectie-efficiëntie te controleren.
- Bereid de oplossingen voor de test. Voor de luciferine oplossing verdunnen luciferine tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mM in Gly Gly-buffer. Voor de reactie buffer verdunnen DTT en ATP 1 mM uiteindelijke concentratie in Gly-Gly buffer. Voor coelenterazine reactiebuffer, verdunnen coelenterazine tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 uM in coelenterazine buffer. Houd luciferine oplossing en coelenterazine reactiebuffer licht beschermd.
- Plaats nu de 96-wells plaat in de luminometer en start het programma 'Wallac 1420 Workstation'.
- Breng de Pump1 in de valk buis die de coelenterazine oplossing. Sluit het deksel zodat er geen licht kan in contact komen met de buis.
- Kies uit het menu de optie 'Dispenser onderhoud' en vink Pump1.
- Selecteer de optie 'Fill'.
- Voor het bewerken van de plaat lay-out kiezen voor de optie 'Explore-protocol en de resultaten' op het menu. Selecteer het protocol en dubbelklik erop. Selecteer nu de putten te lezen.
- Ga terug naar 'Wallac Manager' en klik op 'Start'. De reactie tussen de renilla luciferase en het substraat coelenterazine straalt licht uit met een piek golflengte van 482 nm.
- Na de lezing, ga op 'Dispenser onderhoud' en selecteer 'Empty' en Pump1 om alle resterende oplossing terug vrij te geven aan de buis.
- Nu schuif de tube naar een falcon buis met water en vink 'Flush'.
- Na het spoelen stap, leeg de buis door het selecteren van 'Empty'.
- Plaats de buis van Pump1 in de reactiebuffer valk buis en die van Pump2 in de luciferine falcon buis.
- Verander de plaat lay-out.
- Selecteer 'Fill' voor Pump1 en Pump2 van de 'DiSpenser Onderhoud 'menu.
- Selecteer het protocol en start de lezing. De reactie tussen de Firefly luciferase en het substraat luciferine straalt licht uit met een piek golflengte van 560 nm.
- Aan het eind van de lezing te herhalen van de procedure Empty-Flush-Lege voor Pump1 en Pump2.
- De resultaten zijn nu beschikbaar in de 'Wallac 1420 Explorer'.
- Elk experiment is gekoppeld aan een test nummer, gebruikersnaam, begin-en einddatum.
- De resultaten kunnen nu worden geëxporteerd als een Excel-bestand.
- Voor berekeningen, worden de cellen verdeeld in drie groepen: 1. niet-geschokt referentiemonsters (ingesteld als 100% van de hervouwen vuurvlieg luciferase), 2. cellen zonder moleculaire chaperonne en warmte geschokt, 3. cellen met moleculaire chaperone en warmte geschokt.
6. Representatieve resultaten
Eiwit hervouwing is direct gerelateerd aan de tijd van het herstel dan ook om te testen of het systeem werkt pro Perly, een test moet worden uitgevoerd verzamelen van de cellen op verschillende tijdstippen. Een directe correlatie tijd / percentage van de hervouwing geeft aan dat het experiment goed is uitgevoerd en vormt derhalve een beperkende factor. Het moet echter altijd worden beschouwd dat de hervouwing na heat shock is een verzadigende gebeurtenis en daarom een goede tijdsverloop analyse moeten worden uitgevoerd voordat u begint met een experiment.
Figuur 1. Overzicht van het experiment. In vivo hervouwing-test vereist 3 tot 4 dagen in te vullen. Op dag 1 cellen worden gezaaid en getransfecteerd. De volgende dag cellen worden gesplitst in een kleiner formaat en op dag drie zijn ze warmte geschokt. Op dit punt is het mogelijk om de luciferase assay uit te voeren direct na het oogsten van de cellen of naar de cel pellet op te slaan bij -80 ° C en voer de test in een ander moment
_content ">
Figuur 2. Cel splitsen. Op dag 2 cellen worden gesplitst in een 6-wells plaat. Elke transfectie zal worden verdund in een goed in om alle transfectie op dezelfde plaat te hebben. Elke plaat komt overeen met een bepaalde hersteltijd plus een niet-geschokt referentie plaat.
Figuur 3. Vertegenwoordiger goed resultaat. A. Percentage van hervouwing rechtstreeks door vuurvlieg luciferase activiteit. Elke staaf grafiek geeft het percentage van de hervouwing in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van een moleculaire chaperonne op verschillende hersteltijd punten. B. Correlatie tussen tijd en hervouwing in afwezigheid (zwarte lijn) en in aanwezigheid van (rode lijn) van de chaperonne. De r kwadraat waarden geven een goede correlatie.
In Fig.3A wordt een representatieve resultaten waar de cellen werden verzameld 15, 30, 45, 60 en 120 minuten na de heat shock in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van moleculaire chaperonne. Percentage van de luciferase stijgt hervouwen met een langere hersteltijd en met de transfectie van de moleculaire chaperonne. De correlatie tussen hervouwing en tijd voor de controle (Fig. 3B, zwarte lijn) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (Fig. 3B, rode lijn) wordt weergegeven.
Figuur 4. Vertegenwoordiger slecht resultaat. A. Percentage van hervouwing rechtstreeks door luciferase activiteit. Elke staaf grafiek geeft het percentage van de hervouwing in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van een moleculaire chaperonne op verschillende hersteltijd punten. B. Correlatie tussen tijd en hervouwing in afwezigheid en in aanwezigheid (rood line) van chaperonne. De r kwadraat waarden geven slechte correlatie.
Figuur 4A. Toont een representatief resultaat van een experiment niet correct is uitgevoerd. Zowel de controle (zwarte balken) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (rode balken) vertoonden geen een toename van de eiwit-hervouwing met de tijd. Bovendien heeft transfectie van de moleculaire chaperone niet resulteren in een toename van de hervouwing. Deze arme correlatie wordt bevestigd in Fig. 4B toont een r kwadraat waarde van 0,6619 en 0,1882 respectievelijk voor de controle (zwarte lijn) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (rode lijn).