Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes

Samenvatting

We beschrijven een reeks testen om de expressie niveaus van H1 linker histonen te analyseren. mRNA van de individuele H1 genen worden kwantitatief gemeten door een willekeurige primer op basis reverse transcriptie gevolgd door real-time PCR, terwijl eiwit kwantificering van H1 histonen wordt bereikt met behulp van HPLC-analyse.

Samenvatting

Linker histon H1 bindt aan de nucleosoom kerndeeltje en linker DNA, het vergemakkelijken van het vouwen van chromatine in de hogere orde structuur. H1 is essentieel voor zoogdieren ontwikkeling ¹ en regelt genexpressie in vivo ^2-4. Onder de sterk geconserveerde histon-eiwitten, de familie van de H1 linker histonen is de meest heterogene groep. Er zijn 11 H1 subtypes in zoogdieren die differentieel gereguleerd gedurende de ontwikkeling en in verschillende celtypen. Deze H1 subtypen behoren 5 somatische H1S (H1a-e), de vervanging H1 ^0, 4 kiemcel specifieke H1 subtypes, en H1x ^5. De aanwezigheid van meerdere H1 subtypes die verschillen in het DNA bindingsaffiniteit en chromatine verdichting mogelijkheid ^6-9 biedt een extra niveau van de modulatie van chromatine functie. Zo kwantitatieve analyse van individuele uitdrukking H1 subtypen, beide van mRNA en eiwit, is noodzakelijk voor een beter begrip van de regulering van hogereOm chromatine structuur en functie.

Hier beschrijven een aantal assays ontwikkeld voor het analyseren van de expressie van afzonderlijke subtypes H1 (figuur 1). opregulatie van verschillende H1 variant genen wordt gemeten door een aantal zeer gevoelige en kwantitatieve reverse transcriptie-PCR (qRT-PCR) assays, die sneller en nauwkeuriger en vereisen minder monsters opzichte van de alternatieve benadering van Northern blot analyse. In tegenstelling tot andere cellulaire mRNA berichten mRNAs meeste histoon genen waarvan de meerderheid van genen H1, ontbreekt een lange polyA staart, maar bevatten een stam-lusstructuur aan het 3 'onvertaalde gebied (UTR) ^10. Daarom worden cDNA's bereid uit totaal RNA door reverse transcriptie met random primers plaats van oligo-dT primers. Realtime PCR met primers specifiek voor elk H1 subtypes (Tabel 1) zijn uitgevoerd om zeer kwantitatieve meting van mRNA van de afzonderlijke H1 subtype verkrijgens. Expressie van housekeeping genen worden geanalyseerd als controle voor normalisatie.

De relatieve overvloed aan eiwitten van elk subtype H1 en de kern histonen wordt verkregen door middel van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) analyse van het totaal histonen uit zoogdiercellen ^11-13. De HPLC-methode en elutie voorwaarden die hier worden beschreven voor een optimale scheiding van de muis H1 subtypes. Door het kwantificeren van de HPLC-profiel berekenen we het relatieve aantal afzonderlijke H1 subtypes binnen H1 familie en het H1 nucleosoom verhouding in de cellen te bepalen.

Protocol

1. Monstervoorbereiding en RNA-extractie

1. Voor RNA-extractie, moeten alle gebruikte werkoppervlakken en pipetten worden afgenomen met 70% ethanol en behandeld met RNase decontaminatie oplossing, zoals RNase Zap. Deze werkwijze vermindert de kans RNase verontreiniging en RNA degradatie. Draag handschoenen voor alle procedures.
2. Om RNA-extract van de muis weefsel, ontleden het orgel van de belangstelling van euthanized muis, en was het weefsel in ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 0,13 M NaCl, 5 mM natriumfosfaat heptahydraat, 5 mM mononatriumfosfaat heptahydraat, pH 7,4) . Ga onmiddellijk extractie RNA in stap 1.4. Als sel niet worden verwerkt voor RNA-extractie moet het weefsel onmiddellijk module bevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij -80 ° C voor later gebruik.
3. Indien RNA moet worden gewonnen uit aanhanger celkweek, aspireer cultuur media, spoelen met voldoende hoeveelheid PBS, en voeg Trizol reagens (vitrogen) op de plaat en ga verder met stap 1.4. Voor cellen gekweekt in suspensie oogsten de cellen en pellet cellen door centrifugeren. Gooi media, kort spoel de pellets met PBS, en de pellet de cellen met centrifugeren. Voeg Trizol Reagens en ga verder met stap 1.4.
4. Voldoende Trizol Reagens vereist is om een ​​hoge kwaliteit RNA. Gebruik 1 ml Trizol Reagens om RNA-extract 50 tot 100 mg weefsel, 5 - 10 x 10 ⁶ cellen (voor de opschorting culturen) of per 3,5 cm plaat (voor hechtende culturen). Meng het weefsel in Trizol reagens met Polytron PT2100 homogenisator (of gelijkwaardig). Ga verder met RNA extraheren uit weefsel of cellen volgens de fabrikant de handleiding voor Trizol Reagens (Invitrogen).
5. RNA concentratie gemeten met NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) en RNA kwaliteit wordt geanalyseerd door gelelektroforese. De typische opbrengstniveau 1-10 ug RNA per mg weefsel of 5-15 ug RNA per 1 x 10 ⁶ gekweekte cellen. Om eliminerenmogelijke verontreiniging van RNA uit spoorhoeveelheid genomisch DNA worden RNA monsters behandeld met RNAse-vrij DNase (Sigma AMP-D1) volgens aanwijzingen van de fabrikant. Herhaal RNA-concentratie vastberadenheid en gel-elektroforese om geen afbraak van RNA te garanderen van deze behandeling. Store gehaald RNA bij -80 ° C.

* Opmerking: RNA kan worden geëxtraheerd met RNAeasy kit (Qiagen) volgens de kit handmatig of door DNA / RNA kit (Qiagen) indien beide DNA en RNA gewenst.

2. Kwantitatieve reverse transcriptie PCR (qRT-PCR)

1. Totaal RNA reverse getranscribeerd in cDNA met Superscript III eerste-streng-synthese (Invitrogen). Aangezien mRNA meeste H1 genen ontbreekt poly-A-staart, is het belangrijk om willekeurige hexameren plaats van oligo-dT als primers voor cDNA-synthese. Indien expressie analyse van genen met gepolyadenyleerde berichten op een laag niveau is eveneens gewenst, een mengsel van willekeurige hexameren en oligo-dT should worden gebruikt in de omgekeerde transcriptie (RT) reactie op de omgekeerde transcriptie efficiëntie van gepolyadenyleerde mRNA verbeteren.
2. Voer de RT reactie volgens de handleiding. Kort
   • In 0,5 ml PCR buis combineren 5 ug totaal RNA, 1 ul van 50 ng / pl willekeurige hexameren, 1 pi 10 mM dNTP mix en voeg DEPC-behandeld _H2O de totale reactievolume als 10 pi maken. Mengen en incuberen gedurende 5 minuten bij 65 ° C, gevolgd door 1 minuut incubatie op ijs.
   • Bereid 10 pi cDNA Synthesis Mix: 2 pi 10xRT buffer, 4 pi 25 mM _MgCl2, 2 pi 0,1 M DTT, 1 pi RNaseOut (40 U / pl), 1 ul van SuperScript III RT (200 U / pl) en voeg deze toe aan / primer mengsel RNA.
   • Incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C, gevolgd door 50 minuten bij 50 ° C en beëindigen van de reactie bij 85 ° C gedurende 5 minuten.
   • Elke reactiezone levert typisch 100 tot 250 ng / ul cDNA product. Bewaren cDNA producten bij -20° C of ga direct voor real-time kwantitatieve PCR (qPCR).
3. qPCR nauwkeurig kan kwantificeren van de doelsequentie kopieën met een hoog rendement en reproduceerbaarheid ^14. We kiezen qPCR gemeten SYBR Green kleurstof, die een fluorescent signaal alleen wanneer het intercalates met dubbelstrengs DNA (dsDNA) geeft. Hoewel niet zo specifiek Taqman assay ^14, deze methode is rendabeler en eenvoudiger aan te nemen in het laboratorium, en geeft meer veelzijdigheid qPCR. Daarom is het belangrijk om de amplificatie plot (Figuur 2A) en het derivaat smeltcurven de qPCR product (figuur 2B) onderzoeken reactie-efficiëntie en specificiteit te waarborgen.

Histon subtypes	Muis histon nomenclatuur		Human histon nomenclatuur
	Gene naam	Toetreding nee.	Gene naam	Toetreding nee.
Histon H1a	Hist1h1a	NM_030609	HIST1H1A (H1.1)	NM_005325
Histon H1b	Hist1h1b	NM_020034	HIST1H1B (H1.5)	NM_005322
Histon H1c	Hist1h1c	NM_015786	HIST1H1C (H1.2)	NM_005319
Histon H1d	Hist1h1d	NM_145713	HIST1H1D (H1.3)	NM_005320
Histon H1E	Hist1h1e	NM_015787	HIST1H1E (H1.4)	NM_005321
Histon H1 °	H1f0	NM_008197	H1F0	NM_005318
Histon H1oo	H1foo	NM_183811	H1FOO	NM_153833
Histon H1t	Hist1h1t	NM_010377	HIST1H1T	NM_005323
Histon H1t2	H1fnt	NM_027304	H1FNT	NM_181788
Histon H1x	H1fx	NM_198622	H1FX	NM_006026
Histon Hils1	Hils1	NM_081792	HILS1	AY286318

Tabel 1. Histon H1-subtype nomenclatuur bij muis en mens.

4. Ontwerp en achteruit PCR primers specifiek voor elk H1 gen (Tabel 1). Door de hoge sequentiegelijkenis onder somatische H1S, vooral in het gebied dat overeenkomt met de centrale bolvormige domein, is het essentieel dat de primers voor een specifieke H1 subtype niet uitgelijnd met other H1 genen, of cross versterken andere H1 subtypes. Het is ook belangrijk op te merken dat de meeste H1 genen geen introns bevatten. Zo intron-verspreid over primers meestal aangenomen voor RT-PCR op genomisch besmetting te voorkomen zijn niet beschikbaar. In plaats daarvan moet RNA monsters worden voorbehandeld met DNase (zie 1.5) voor een spoorhoeveelheid genomic vervuiling te voorkomen. Bovendien RT (-) te-qPCR worden uitgevoerd in parallel met het ontbreken van genomische verontreiniging in de cDNA-monsters te bevestigen.
5. Ook ontwerp van primers voor interne referentie genen waarvan de expressie worden niet gewijzigd bij monsters. Vaak huishoudelijke genen, zoals glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) en bèta-actine-genen zijn gekozen als referentie genen. qPCR signalen van housekeeping genen dienen als normalisering controles.
6. Bereid een PCR-reactie (totaal volume van 25 pi) als volgt: 12,5 ßl 2x IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) (die dNTPs, 50 U / ml ItaQ DNA polymerase, 6 mM _MgCl2, SYBR Green I en 20nM fluoresceïne), 2 pi van 4 ng / ul cDNA, 1,25 ul van 10 nM vooruit / achteruit primer mix, en 9,25 ul van DDH ₂ O, en meng goed in microseal 96-well PCR-plaat. Gebruik plakkende microseal 'B' (Bio-Rad), zodat de plaat deksel afgesloten de plaat. Kort Tik of vortex de PCR-plaat, en spin down de reactie mengsels door een korte centrifugeren. Plaats de plaat in MyIQ Een kleur real-time PCR Detection System (Bio-Rad) voor qPCR.
7. Wij de volgende qPCR voorwaarden: 95 ° C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 10 seconden 60 ° C gedurende 20 seconden 72 ° C gedurende 30 seconden. Onderzoek de versterking curven (figuur 2A) voor PCR-efficiëntie en Ct (drempel van de cyclus) waarden. De drempel lijn kan automatisch worden ingesteld door de IQ5 Optical System Software versie 2.0.
8. De primer efficiëntie en optimale concentratie die nodig cDNA kan worden getest door een standaard curve assay, waarbij een verdunning van genomisch DNA is gebruikt voor qPCR en Ct-waarden worden uitgezet tegen log van template-DNA bedrag. Een geoptimaliseerde qPCR assay met primers van hoge specificiteit en efficiëntie geeft een lineaire standaardcurve, met de determinatiecoëfficiënt (R ^2)> 0,98. Voorkom primers met amplicon lengte van meer dan 200 bp, die meestal slecht amplificatie efficiëntie.
9. Omdat SYBR Green detecteert dsDNA, is het essentieel om een ​​smeltcurve run na de qPCR om ervoor te zorgen dat de gewenste amplicon, maar niet primer dimeren of verontreiniging bevatten, worden versterkt en gedetecteerd uit te voeren. Voor smelt-curve analyse programma qPCR instrument de monsters verwarmen van 55 ° C tot 95 ° C in 0,5 ° C stappen met gegevensverzameling. De standaardinstelling smelt-curve analyse voor MyIQ (Bio-Rad) instrument is de volgende: 95 ° C gedurende 1 minuut, 55 ° C gedurende 1 minuut, gevolgd door 81 cycli van 10 seconden bij 55 ° C gewenste smelten curve + temp 0,5 ° C (camera verzamelt gegevens bij elke cyclus).
10. Sinds smelttemperatuur (Tm) van dsDNA is afhankelijk amplicon lengte GC-gehalte, zullen verschillende amplicons verschillende Tm (s). Onderzoek afgeleide smeltcurven de qPCR producten aan de specifieke smelttemperatuur gewenste amplicons en het ontbreken van ruis amplicon pieken (Figuur 2B) te bevestigen.
11. Bereid twee-of drievoud reacties voor elke assay voor statistische analyse. Voeg negatieve controles voor qRT-PCR zoals RT (-)-qPCR (qPCR met RNA als templaat zonder reverse transcriptie) en qPCR zonder cDNA, RNA of DNA bron toegevoegd in de PCR-mix. RT (-)-qPCR kan dienen als controle voor mogelijke genomisch DNA verontreiniging (RT (-) in figuur 2 en 3).
12. Analyseer qPCR gegevens met IQ5 Optical System Software versie 2.0 (Bio-Rad). Normaliseren de uitdrukking waarden van H1 isovorm genen met de expressie van huishoudelijke gen (bv. GAPDH, ß-actine, HPRT) om de relatieve expressie van H1 genen te verkrijgen.

ove_title "> 3. Voorbereiding van Total histonen

* Alle procedures worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C.

1. Ontleden muis weefsel en spoel het met ijskoude PBS. (Indien niet begeef u onmiddellijk naar extractie, snap bevriezen en bewaren van de monsters als beschreven in stap 1.2.) Hak het weefsel in stukken met een scheermesje. Overdracht gehakt om een ​​Dounce homogenisator (B stamper). Voeg 10 ml Sucrose buffer (0,3 M sucrose, 15 mM NaCl, 10 mM HEPES [pH 7,9], 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, Complete Mini Proteaseremmer Cocktail Tablet toevoegen vers) per gram weefsel. Meng het weefsel met 10-15 slagen.
2. Breng de homogenaten om een ​​15 ml buis, draaien op 500 rpm gedurende 30 seconden (centrifuge model: Eppendorf 5810R), dus wees het supernatant over te dragen aan een nieuwe buis (gooi de pellet-weefselstukjes), en gecentrifugeerd bij 2000 rpm gedurende 5 minuten, tot pellet cellen. Ga verder naar stap 3.4.
3. Als histonen en chromatine moeten worden geëxtraheerd uit de cellen gekweekt in monolaag, spoelmet PBS, voeg PBS om de cultuur schotel, en het oogsten van de cellen met behulp van cel-schraper, en pellet cellen door centrifugeren. Voor cellen gekweekt in suspensie pellet cellen door centrifugeren.
4. Resuspendeer de celpellet in 10 ml buffer Sucrose aangevuld met 0,5% NP-40 (per gram weefsel vanaf hoeveelheid of 10 (8) cellen). Breng het monster op een Dounce homogenisator (B stamper) en Dounce 10 slagen binnen 20 minuten incubatie. Op dit moment zijn kernen verkregen. Onderzoek de kernen kwaliteit onder een microscoop. Pellet de kernen door centrifugatie bij 2000 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
5. Resuspendeer de kernen pellet in 3 ml buffer met hoog zoutgehalte (0,35 M KCl, 10 mM Tris [pH 7,2], 5 mM _MgCl2, 0,5 mM PMSF - vers toevoegen vóór het gebruik) per 1 g weefsel of 10 (8) cellen. Breng het monster tot een kleine Dounce homogenisator (B stamper) en homogeniseer met 5-10 slagen.
6. Aliquot de suspensie in 3 Eppendorf buizen (1 ml), incuberen op ijs gedurende 20 minuten, gevolgd doorcentrifugeren bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten pellet chromatine. Verwijder het supernatant.
7. Voeg 0,8 ml 0,2 _NH2 SO ₄ elk chromatine pellet. Gebruik een eppendorfbuisje stamper Dounce om goed te slijpen de korrel tot de pellet volledig gescheiden. Incubeer de monsters op een draaiplateau bij 4 ° C geroerd. Totaal histonen geëxtraheerd met deze stap zuurbehandeling.
8. Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten. Breng de bovenstaande (histon uittreksels) in twee Eppendorf buizen (400 ul / buis). Gooi de pellet. Voeg 2,5 volumes (1 ml) ijskoude ethanol aan elke buis .. Bewaar de monsters bij -20 ° C gedurende de nacht.
9. Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten op pellet totaal histonen, gooi het supernatant. Was de pellet drie keer met 70% EtOH, laat op de bank voor 20-30 minuten aan de lucht drogen. Bewaar de gedroogde eiwitten bij -80 ° C of ontbinden in DDH ₂ O en onmiddellijk tot HPLC analyse. Gedroogde eiwitten kunnen worden opgeslagenbij -80 ° C gedurende 1 jaar.

4. HPLC-analyse van de Linker histonen

1. Resuspendeer de histoon pellet in de aanbevolen hoeveelheden DDH ₂ O afhankelijk van de capaciteit van omgekeerde fase HPLC kolom en de instrument. We maken gebruik van C18 omgekeerde fase kolom 250 x 4,6 mm (Vydac) en Äktapurifier UPC 900 instrument (GE Healthcare) voor HPLC-analyse. We gewoonlijk los 50 100μg totale histonen in 100 ul DDH ₂ 0 voor analyse.
2. Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 5 minuten om onoplosbare resten te verwijderen. Bradford eiwit assay gebruikt om de hoeveelheid eiwit worden geïnjecteerd op de kolom te bepalen. Injecteer 50-100 ug totaal eiwit in de omgekeerde fase HPLC kolom systeem. Laden van een grote hoeveelheid eiwitten moet worden vermeden om verstopping van de kolom te voorkomen.
3. Fractioneren linker histonen en histonen kern met toenemende gradiënt acetonitril als vermeld in tabel 2.

(Min.) Acetonitrile/0.1% TFA (%) 0,1% TFA / DDH ₂ O (%) 0 0 100 1 5 95 11 25 75 26 30 70 45 35 65 66 40 60 75 43 57 126 55 45 131 90 10 136 5 95

Tabel 2. Het verhogen van acetonitril verloop in de tijd.

4. Het afvalwater wordt gecontroleerd bij 214 nm, en de HPLC-profielen (Figure 4) worden geregistreerd en geanalyseerd met behulp van Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) met UNICORN 5.11 software (GE Healthcare). Het eiwit fracties kunnen ook verzameld worden met de fractie auto-collector (Frac-920 - GE) voor verdere analyse, zoals SDS-PAGE en massaspectrometrie.
5. De A ₂₁₄ waarden van de pieken van elke H1 subtype en H2B worden genormaliseerd door het aantal peptidebindingen van telkens histoneiwit. De relatieve verhoudingen tussen de afzonderlijke H1 histon subtypes binnen de familie H1, alsmede de verhouding van H1 subtypes aan nucleosome kerndeeltjes kan worden berekend uit deze genormaliseerde A ₂₁₄ waarden (Figuur 5).

5. Representatieve resultaten

De lijst van zoogdieren H1 subtypen algemeen stroomschema en representatieve resultaten van de expressie analyse van individuele histon H1 genen zijn weergegeven in tabel 1, figuur 1 en figuur 2.5 resp.Figuur 2A toont typische versterking rondingen van H1a qPCR reacties met behulp van cDNA bereid uit muizen lever en mESCs, terwijl figuur 2B toont de afgeleide smelten rondingen van de overeenkomstige amplicons. De smeltcurve toont een karakteristieke piek bij smelttemperatuur (Tm) bij 86 ° C voor de PCR amplicon H1a, en geen niet-specifieke achtergrond pieken suggereert hoge specificiteit van H1a qPCR assay. Evaluatie van de versterking plot (Figuur 2A) toont aan dat de drievoud qPCR reacties van elk monster consistente signalen gaven met bijna identieke Ct-waarden, hetgeen wijst op een hoge reproduceerbaarheid. Het ontbreken van amplicons opbouw van RT (-)-qPCR reacties blijkt dat genomisch DNA verontreiniging niet aanwezig was, en minimaal. Gebruik makend van de Ct-waarden van H1 genen en het huishouden genen, zoals GAPDH, werden de relatieve RNA expressie niveaus van elke H1 gen berekend. Voorbeelden van berekende resultaten voor H1 ° en H1a genen worden getoond in Figuur 3. De relatieve expressieniveaus van mRNA H1a zijn hoger in vergelijking met mESCs muizenlever, terwijl H1 ° uitdrukking is veel hoger in de lever dan in mESCs.

Het verschil in expressie van H1a of H1 ° in mES ten opzichte van volwassen muizen lever blijkt ook uit HPLC-profielen van histon-eiwitten (figuur 4). H1 ° de differentiatie specifieke H1, wordt geaccumuleerd om een grote hoeveelheid in volwassen weefsels goed voor 27,2% van de totale H1 in volwassen lever (figuur 5A). Daarentegen H1 ° eiwit nauwelijks in ongedifferentieerde mESCs (Figuur 4B). Anderzijds wordt H1a sterk tot expressie, zowel in mRNA transcripten en eiwitten in mESCs (figuur 3 en 4B). Door middel van kwantificering van H1 pieken in de HPLC-profiel, wordt het relatieve aandeel van elk individu H1 subtype binnen de H1 familie bepaald (figuur 5A). Bovendien is de waarde van de afzonderlijke H1 subtype (oftotale H1) per nucleosome kan worden berekend uit de verhouding van de genormaliseerde A ₂₁₄ piekwaarde overeenkomstige H1 subtypes (of de som van de totale H1) de helft van de genormaliseerde A ₂₁₄ waarden H2B (figuur 5B).

Figuur 1. Algemeen schema van expressie analyse van zoogdieren linker-histon-subtypes.

Figuur 2. Vertegenwoordiger resultaten van H1a qPCR test. (A) Versterking perceel van H1a qPCR test. De drempel lijn en Ct-waarden die de IQ5 Optical System Software worden aangegeven. (B) Afgeleide smelt-curven van qPCR producten in (A).

Figuur 3. QRT-PCR analyse van mRNA niveaus H1a en H1 ° mESCs en volwassen mouse lever. Y-as geeft de relatieve expressieniveaus van H1 genen die van de referentie-gen GAPDH. qPCR met RT (-) monsters (RNA zonder reverse transcriptie) toont weinig of geen signalen.

Figuur 4. HPLC analyse van histonen uit zoogdiercellen. Omgekeerde fase HPLC analyse van 100 ug totaal histonen uit volwassen muizenlever (A) en muizen SER (B). X-as: elutietijd. Y-as: MAU, milli-absorptie-eenheden.

Figuur 5. H1 subtype samenstelling en H1 per nucleosoom ratio's bij volwassen muis lever. De A ₂₁₄ waarden van het piekoppervlak voor elke H1 isovorm en H2B worden berekend UNICORN 5,11 software (GE Healthcare) en genormaliseerd door het aantal peptidebindingen in de overeenkomstige histoneiwit. De som van genormaliseerde A₂₁₄ waarden van alle H1 subtypes wordt verkregen zijn totale H1. Het percentage van de totale H1 per H1 subtype (A) en de verhouding van H1 tot nucleosome (voorgesteld door de helft van de genormaliseerde A ₂₁₄ waarden H2B) (B) in volwassen muizenlever worden berekend uit de getoonde profiel HPLC figuur 4A.

Discussie

De set van testen die hier in staat stellen een uitgebreide analyse van de expressie niveaus van zoogdieren linker histon subtypes. Goed ontworpen qRT-PCR testen leveren zeer gevoelige en nauwkeurige metingen van RNA-boodschappen van alle zoogdieren histon H1 genen. De kritische deel van qRT-PCR assays voor linker histon-subtype genen is de voorbereiding van cDNA met behulp van willekeurige primer op basis reverse transcriptie. mRNA meeste histon genen waaronder de meeste H1 genen bevatten geen lange poly-A staart die i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
RNase Zap	Applied Biosystems	AM9780
Trizol Reagens	Invitrogen	15596-018
SuperScriptIII	Invitrogen	18080-051
Absolute ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4
IQ SYBR Green	Bio-Rad	170-8880
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Deoxyribonuclease I	Sigma	AMP-D1
Microseal 96-well PCR-plaat	Bio-Rad	MSP-9605
Adhesive Seals microseal 'B'	Bio-Rad	MSB-1001
Sucrose	Agros Organics	AC40594
Dibasisch heptahydraat (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O)	Fisher Scientific	BP332
Natriumchloride (NaCl)	Amerikaanse Bioanalytical	AB01915
Natriumdiwaterstoffosfaat heptahydraat (NaH 2 PO 4 · 7H2O)	Fisher Scientific	BP-330
HEPES	Fisher Scientific	BP310
Compleet Mini proteinase inhibitor cocktail tablet	Roche Applied Science	11836153001
EDTA	Sigma	E-5134
Phenylmethanesulfonyl (PMSF)	Amerikaanse Bioanalytical	AB01620
Nonidet-40 (NP-40)	Amerikaanse Bioanalytical	AB01425
Kaliumchloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366
Tris [hydroxymethyl aminomethaan]	Amerikaanse Bioanalytical	AB02000
Magnesiumchloride (MgCl2)	Fisher Scientific	BP214
Zwavelzuur (H2SO4)	VWR	VW3648-3
Ammoniumhydroxide (NH4OH)	Agros Organics	AC42330
Bradford Protein Assay	Bio-Rad	500-0001
Acetonitril	EMD	AX0145-1
Trifluorazijnzuur (TFA)	JTBaker	9470-01