Kwantitatieve analyse van Random migratie van cellen met behulp van time-lapse video Microscopie

Summary

Deze methode maakt het mogelijk controle van de cellen in real time en kwantitatieve metingen van verschillende celmigratie parameters, zoals snelheid, verplaatsing, en snelheid. In tegenstelling tot de traditionele methoden, is deze real-time benadering niet gebaseerd op eindpunt kwantitatieve migratie metingen, in plaats daarvan het laat de controle en het berekenen van verschillende parameters continu.

Abstract

Cel migratie is een dynamisch proces, wat belangrijk is voor de embryonale ontwikkeling, weefselherstel, werking van het immuunsysteem, en tumor invasie ^{1, 2.} Tijdens directionele migratie cellen snel bewegen in reactie op een extracellulair chemotactische signaal, of als reactie op signalen intrinsieke ³ door de basis motiliteit machines. Willekeurige migratie doet zich voor wanneer een cel bezit lage intrinsieke gerichtheid, waardoor de cellen aan hun lokale omgeving te verkennen.

Cel migratie is een complex proces, bij de eerste respons cel ondergaat polarisatie en strekt zich uitsteeksels in de richting van de migratie ^2. Traditionele methoden om migratie, zoals de Boyden kamer migratie test te meten is een eenvoudige methode om te meten chemotaxis in vitro, die het mogelijk maakt het meten van migratie als een eindpunt resultaat. Echter, deze benadering laat geen meting van de individuele migratie parameters, noch is het in staat te stellen Visualization van de morfologische veranderingen die cel ondergaat tijdens de migratie.

Hier presenteren we een methode die ons in staat stelt om migrerende cellen in real time met behulp van video - time lapse microscopie. Sinds celmigratie en invasie zijn kenmerken van kanker, zal deze methode van toepassing zijn in het bestuderen van kankercel migratie en invasie in vitro. Willekeurige migratie van bloedplaatjes wordt beschouwd als een van de parameters van de functie van de bloedplaatjes ^4, vandaar deze methode kan ook nuttig zijn in het bestuderen van bloedplaatjes functies. Deze test heeft het voordeel dat snel en betrouwbaar en reproduceerbaar, en vereist geen optimalisatie van celaantallen. Om fysiologisch geschikte omstandigheden voor cellen te handhaven wordt de microscoop voorzien CO ₂ toevoer en thermostaat. Cell beweging gevolgd door's in een camera aangebracht op de microscoop bij regelmatige intervallen. Celmigratie kan worden berekend door de gemiddelde snelheid enverage verplaatsing berekend door Slidebook software.

Protocol

1. Voorbereiding van gecoat met Collageen

1. Verdun collageen tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml in Opti-Mem media.
2. Laag 6 wells platen met collageen door toevoeging van 1,5 ml van stap 1 in elk putje. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
3. De volgende dag, was de plaat 2 keer met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar ze in PBS.

2. Cel Voorbereiding en zaaien op een 6-well Plate

Opmerking: Gebruik warm media en PBS om optimale omstandigheden voor de cel beweging zorgen

1. Grow MDA-MB-231 (een invasieve borstkanker cellijn) dun in Du....

Discussion

De real-time willekeurige migratie-test maakt een nauwkeurige, gevoelige, analyse van celmigratie parameters, zoals snelheid en verplaatsing. Deze methode is niet beperkt tot punt meetwaarde beëindigen vandaar is kwantitatief. Aangezien worden cellen gecontroleerd normale DMEM medium met serum, vermindert de nadelige gevolgen van meer incubatie in serumvrij medium. Gebleken is dat de verplaatsing van cellen is afhankelijk van de opmaak en breken cel contact met het substraat ^8, zodat deze methode kan worden g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	Gemini Bio-producten	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Collageen	BD	354231
Microscoop met Live Cell kamer & Geautomatiseerde kruistafel controller	Olympus	Olympus 1X81
Milieu regelkamer	Neue	Neue Live Cell Kamer	Ours is een custom-built rechthoekige glazen plaat boven voor de juiste optiek door de top van de kamer. De rechthoekige vorm is geschikt voor multi-well platen gebruikt in veel van onze experimentelets.
Geautomatiseerde kruistafel	Voorafgaand	Voorafgaand ProScan	Dit zorgt voor een precieze terug te keren naar geselecteerde XY positie te vermenigvuldigen tijdens de time lapse microscopie.
Camera		Hamamatsu EM camera C9100
Software	Typisch gekocht door microscoop leverancier, zoals Olympus	Slide Boek 5