$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Animal Onderwerpen
1.1. Behandeling
- Alle dierlijke procedures dienen te worden uitgevoerd met toestemming van Animal van de lokale instelling Zorg en ethische commissie en in overeenstemming met het gebruik en het Comite en de National Institutes of Health richtlijnen, met maatregelen die zijn genomen om pijn en ongemak te minimaliseren.
- Onze muizen werden gehuisvest in een temperatuur-gecontroleerde omstandigheden op een 12-uurs omgekeerde licht en donker cyclus, terwijl gevoed muis chow en water ad libitum.
- Voor onderzoeken bij volwassen regeneratie, moet muizen minimaal 6 weken oud zijn als de heupzenuw verliefd wordt uitgevoerd. Deze leeftijd is dan het tijdstip waarop het snoeien van polyneural neuromusculaire verbindingen plaatsvinden.
- In deze experimenten hebben we 6-8 weken oud C57BL / 6 muizen verkregen van Charles River. Bij het vergelijken van regeneratie na heupzenuw verliefd (dat wil zeggen: snelheid van axon groei) muizenstammen moet hetzelfde zijn, zoals verschillen in de axonale regeneratie zijn nieted verschillende inteeltstammen 15,16. Als genetisch gemanipuleerde muizen worden gebruikt, nestgenoot controles meest geschikt.
1.2. Chirurgische Voorbereiding
- Dieren zijn zeer verdoofd voor operatie met een cocktail van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) via intraperitoneale injectie. Elk dier krijgt ook een subcutane injectie van meloxicam (10 mg / kg) tot post-operatieve pijn te minimaliseren.
- Beide achterhand zijn zorgvuldig geschoren met behulp van een chirurgische clippers (Roboz, RC-5903) en ontharen wordt aangevuld met Nair ontharingscrème (te vinden op lokaal apotheek).
- Huid wordt gereinigd met behulp van steriele katoenen tip applicators en betadine chirurgische scrub (Fisher Scientific, 19,066,452).
- Oogzalf (Fisher Scientific, 19082795) wordt toegepast op de ogen met behulp van steriele katoenen tip applicators.
- De muis is geplaatst op een schone roestvrij stalen plaat, waarbij is een voorverwarmde homeot geplaatsthermic deken systeem (Harvard Apparatus, 507222F). Animal temperatuur wordt op 37 ° C.
- Alle ledematen worden vastgeplakt, met zorg genomen om de achterste ledematen te positioneren symmetrisch, zodat het kniegewricht een rechte hoek met het lichaam (Figuur 1, paneel A) maakt.
- De chirurgische veld is bedekt met een steriel laken. Alle instrumenten worden gesteriliseerd door autoclaaf of warme kraal sterilisatie (Fine Science Tools, 18000-45) en de chirurg draagt een masker, schort en steriele handschoenen.
2. Reproduceerbare heupzenuw Crush
- Na de bereiding wordt een semi-cirkelvormige incisie over de middellijn (figuur 1) in de huid. De huid wordt zacht ontleed van de onderliggende spieren, en gevouwen uit te blijven van de manier waarop tijdens de procedure. Het wordt vochtig gehouden met behulp van toepassingen van 0,1 ml steriele zoutoplossing (Hospira, 0409-4888-20) tijdens de procedure.
- Het openen van de fasciale vlak tussen de gluteus maximus en de voorste hoofd van de biceps femoris onthult de heupzenuw (Figuur 1, paneel A). Voor een chirurgische controle, moet de contralaterale heupzenuw worden blootgesteld en gemobiliseerd, maar intact gelaten. De gluteale spieren wordt dan opnieuw tegen en gehecht met een 6-0 gevlochten zijden, niet-absorbeerbare hechtdraden (Roboz, SUT-1073-11).
- De experimentele heupzenuw wordt vervolgens blootgesteld op dezelfde manier, met oprolmechanisme in de plaats te visualiseren (Figuur 1, paneel B) te verlichten. De oprolmechanismen worden gesteriliseerd.
Let op: hoewel oprolmechanisme systemen zijn commercieel beschikbaar zijn, zijn ze vaak vrij duur. We waren in staat tot een bevredigende oprolmechanisme systeem met behulp van goedkope hardware leveringen en insecten pinnen (zie ook Materiaal sectie) te maken. - De heupzenuw is dan voorzichtig bevrijd van het omliggende bindweefsel met behulp van iridectomie schaar.
- Met behulp van een fijne 5/45 (Fine Science Tools, 11251-35) tang, wordt de zenuw op de onderkaak van een super-fijne hemostatische tang (Fijn ook wetenschapls, 13020-12). De drie bundels zijn elkaar afgestemd, niet op elkaar (Figuur 1 inzet B). De hemostatische tang zijn gegraveerd met een cijfer op 1,5 mm van de tip. De buitenste deel van de nervus wordt geplaatst in lijn met dit merk voordat crush. Dit zorgt voor een crush van uniforme breedte, en dat de zenuw niet verder reikt dan de bek van de hemostatische tang bij afgevlakt als gevolg van de verpletterende kracht. Als de zenuw gaat verder dan de tang tip de zenuw slechts gedeeltelijk worden verpletterd.
- De box is loodrecht aan de zenuw op 45 mm van de derde teen, zoals gemeten door een draad die het pad van de nervus ischiadicus benadert. De zenuw eenmaal vermalen gedurende 15 seconden bij 3 klikken van de hemostatische pincet. Er wordt op gelet dat de zenuw te rekken. Wanneer de hemostats opnieuw worden geopend, moet de gehele zenuw doorschijnend zijn op de crush site.
- Een tweede paar hemostatische pincet (identiek aan de eerste) dat vooraf gedompeld is inpoederkool (Fisher Scientific, C272-500) wordt gebruikt om de crush plaats markeren. De zenuw vergruisd dezelfde pletten plaats gedurende 15 seconden bij 3 klikken. Geen koolstof-markering moet verder gaan dan de grens van de eerste verliefdheid. Dit is vooral belangrijk als precieze aanduiding van de box plaats nodig. Vóór het gebruik wordt koolstofpoeder gesteriliseerd door bestraling met UV licht gedurende twee uur en daarna wordt behandeld met steriele techniek.
- Om de tang in koolstof voordipbad maar sluit algemeen koolstof op de operatieplaats, de tang wordt geopend poederkool, daarna voorzichtig gesloten (niet geklikt) gesloten en de kool op de buitenzijde van de hemostats wordt afgeveegd met steriel gaas . De tangen worden gecontroleerd onder ten minste 3x vergroting om te controleren of de verpletterende oppervlakken gelijkmatig zijn bedekt in poedervorm koolstof. Indien nodig worden zij opnieuw gedoopt en veegde.
- De gluteale spieren wordt opnieuw tegen en gehecht op dezelfde wijze als de contralaterale zijde.
- Ten slotte wordt de huid incisie gesloten met 9 mm reflex clips (World precisie-instrumenten, 500346; Applier: 500345). Als 9 mm reflex clips zijn te vinden op beweging, kleinere reflex clips of 6-0 hechtingen (Roboz, SUT-1073-11) te beperken kunnen worden gebruikt.
3. Post-operatieve zorg
- Naar aanleiding van de procedure, worden de dieren op een verwarmingselement bij 37 ° C tot ze tekenen van beweging.
- Vervolgens worden ze bewogen naar hun kooi, waar water en voedsel gemakkelijk toegankelijk op de vloer in de vorm van Hydrogel en bevochtigde voedsel.
4. Semi-Thin Voorbereiding
- Na een overdosis pentobarbital (300 mg / kg) het been spieren wordt verwijderd om de heupzenuw * bloot te leggen. Met de zenuw nog in situ wordt de achterhand ondergedompeld in 2% paraformaldehyde en 2% gluteraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer op ijs gedurende 30 minuten.
* Als het invullen van hele berg spieren voorbereiding, spieren zijn oogsted voor het blootstellen van de heupzenuw. - De zenuw wordt voorzichtig verwijderd, met zorg voor alleen omgaan met het proximale uiteinde. Dan is de zenuw is achteraf vastgestelde in dezelfde fixeermiddel voor drie extra uren.
- Na fixatie de zenuw driemaal gewassen in 0,1 M fosfaatbuffer.
- De zenuw ondergedompeld in 2% osmiumtetroxide in 0,1 M fosfaatbuffer gedurende een uur.
- De zenuw wordt vervolgens gedehydrateerd door opeenvolgende onderdompeling in meer geconcentreerde ethanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100% 100%, 100%). Elke onderdompeling is 15 minuten.
- De gedroogde zenuw wordt twee keer geïncubeerd in propyleenoxide gedurende drie minuten elk.
- Vervolgens zenuw ondergedompeld in een 1:1 mengsel van propyleenoxide en insluiten 812 ten minste 6 uur (meestal 's nachts).
- Dan wordt de zenuw wordt ondergedompeld in een 2:1 mengsel van propyleenoxide en embedden 812 's nachts.
- Ten slotte is de zenuw wordt ondergedompeld in pure Embed 812 gedurende zes uur, dan is ingebed in de juiste vorm en banent bij 60 ° C gedurende 48 uur.
- 1,0 pm secties worden gesneden uit de distale zenuw stomp op een vaste afstand van de crush site met behulp van een Ultracut UCT ultramicrotoom (Leica) met een glazen mes en gekleurd met toluidine blauw. Dunne delen kan ook worden geproduceerd voor de behandeling van ultrastructuur door elektronenmicroscopie.
5. Hele Mount Muscle Voorbereiding
- Eerste muizen worden opgeofferd met een overdosis pentobarbital (300 mg / kg) en de achterste ledematen zijn verwijderd op de knieën.
- Vier spieren in de achterpoten ledematen zijn verwijderd voor analyse: de tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL), soleus en peroneus longus.
- Alle spieren worden verwijderd via een zorgvuldige dissectie en opgespeld door hun bindweefsel om een zwarte Sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) gecoate schaal. Zij worden gespoeld in PBS en gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten.
- De TA wordt dan gespoeld in PBS, ingebed in OCT (Fisher Scientific, 14-373-65) en snel ingevroren in een bad van aceton en droog ijs.
- Het wordt opgeslagen bij -80 ° C slijpplaatonderzoek bij geheel gemonteerde preparaat niet. In het algemeen TA te dik voldoende geheel steunen.
- De EDL, soleus en peroneus longus worden gespoeld 3 x 10 minuten in PBS, geplaatst in 0,1 M glycine * (Fisher Scientific, AC12007-0010, verdund in PBS) gedurende 30 minuten en 3 x 10 minuten gespoeld met PBS weer. Ze worden dan afgeschrikt in ijskoude 100% methanol precies 5 minuten bij -20 ° C, 3 x 10 minuten gespoeld met PBS en overgoten met fluorescent geconjugeerde alpha-bungarotoxin (verdund in PBS 1:200) gedurende 30 minuten. De spieren gespoeld 3 x 10 minuten in PBS, gevolgd door 1 uur blok 2% BSA (KPL, 50-61-00) en 0,2% Triton X-100 (Dot Scientific Incorporated, 9002-93-1) in PBS * en geïncubeerd nacht onder schommelen bij 4 ° C in een cocktail van primaire antilichamen verdund in hetzelfde 2% BSA/0.2% Triton blok.
* Glycine en blokkeren worden bereid op dezelfde dag als spier oogsten en gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik. - Om axonen en neuromusculaire synapsen te markeren, gebruiken we een combinatie van een muis monoklonaal neurofilament marker (Covance, SMI-312R; verdunde 1:1000), een muis monoklonaal synaptische blaasjes marker (SV2 DSHB, verdund 1:1000), en rhodamine geconjugeerde alpha -bungarotoxin (Sigma-Aldrich, verdund 1:200). Om reactieve Schwann cellen te markeren we gebruik van konijnen-anti-GAP-43 (Novus Biologicals, NB300-143, verdund 1/500). De primaire antilichamen worden gevisualiseerd met een IgG1 subtype specifieke fluoresceïne geconjugeerd geiten anti-muis secundair antilichaam en DyLight 649 geconjugeerd ezel anti-konijn (Jackson ImmunoResearch verdund 1:200).
- De volgende dag worden de spieren gespoeld in PBS gedurende 3 x 10 minuten en geïncubeerd in secundaire antilichamen verdund 1:200 (in 2% BSA/0.2% Triton blokkeeroplossing). Deze worden vervolgens gespoeld 2 x 10 minuten in PBS, followed door een 5-minuten onderdompeling in DAPI (Invitrogen, D3571, verdund tot 300 nm in gedeïoniseerd water), en nog eens 10 minuten spoelen in PBS.
- Elke spier wordt dan ontleed op een zwarte Sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) gecoat petrischaal. Aanvankelijk pezen worden verwijderd om de insertie punten in de spier en de spieren worden verdund door afpellen inrichting spiervezels (figuur 3 panelen AC). Er wordt voor buitenoppervlak van de spieren, waaronder de eindplaat banden (figuur 3 panelen DF) te behouden. De resulterende spieren zijn gemonteerd op plus dia's (Fisher Scientific, 12-550-15) met Vectashield (Vector Laboratories, H-1000) en 22 x 40 mm glas dekglaasjes (Fisher Scientific, 12-548-5C) verzegeld door duidelijke nagellak tweezijdig. Indien juist gemonteerd op de foto de eindplaat band contact op met de dekglaasje aan.
6. Het meten van Regeneratie
- Regeneratie kan worden geschat in alle drie de spieren (peroneus, EDL, en soleus). We hebben vaak examine regeneratie veertien dagen na zenuw verliefd, een tijdstip waarop een aanzienlijk percentage van NMS opnieuw worden geïnnerveerd. Zowel de vroegere en latere tijdstippen zijn ook geschikt, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag wordt gesteld. In elke spier, wordt re-innervatie van de gehele eindplaat band onderzocht. Alleen en face oppervlak NMS worden gescoord. Op deze manier kan minstens 200 NMS per spier snel worden onderzocht.
- Om spieren scoren re-innervatie bepalen we een "re-innervatie ratio". De noemer is het aantal gedenerveerde neuromusculaire verbindingen zoals gelabeld door α-bungarotoxin bindend en Schwann cel GAP-43 immunoreactiviteit. De teller is het aantal re-geïnnerveerde NMS als gelabeld door neurofilament/SV2 immunoreactiviteit. Indien nodig, kan NMS worden geclassificeerd als gedeeltelijk (onvolledige dekking van de α-bungarotoxin door SV2) of volledig (volledige dekking van α-bungarotoxin door SV2) re-geïnnerveerd. Voor voorbeelden van re-geïnnerveerde en gedenerveerde NMS zie figuur 3, panelen G en H.
7. Representatieve resultaten
Figuur 1. Schema van de achterpootspier anatomie belangrijk om de zenuwen crush. A. Een semi-cirkelvormige incisie in de huid is gemaakt het openbaren van de onderliggende spieren. B. De musculus musculatuur is gescheiden, en de heupzenuw geopenbaard (stap 2.4). Een pijl geeft de geschatte verliefd site. Retractor plaatsing wordt weergegeven als een algemene richtlijn, en wordt aangepast bij elke operatie om visualisatie van de nervus en aanpak van de hemostatische tang voor het pletten te vergemakkelijken B (inzet):. Plaatsing van de nervus op de onderkaak van de hemostatische tang net voor verbrijzeling (stap 2.5 hierboven). Aparte bundels zijn gelabeld om aan te tonen dat ze horizontaal naast, maar niet verticaal, tijdens de crush. Hoewel drie FASCicles worden aangeduid in dit diagram, kan men ook een kwart fascicle, de articulaire tak van de peroneus. Voor een meer gedetailleerde anatomische tekening van de vertakking patronen van de nervus ischiadicus bundels distaal van de crush punt, verwijzen wij u naar Anatomy Greene's van de Rat, figuur 188 17.
Figuur 2. Een carbon-gemarkeerde verliefd site in situ en toluidine blauw-gekleurde, semi-dunne delen van gemalen heupzenuw. A. Een voorbeeld van een crush site in situ (linker achterpoot ledematen). Zwart carbon geeft de crush site. Het sterretje markeert een tak van de nervus tibialis dat de dij spieren innerveert en dient als een handig herkenningspunt tijdens verliefd operatie. De tibia divisie van de nervus ischiadicus wordt geschetst in het blauw, de peroneale in het groen, en de Sural in het geel. B. Semi-dunne secties tonen een complete verbrijzeling uitgevoerd met hemostatische krachtps. C. Semi-dunne secties tonen een onvolledige verpletteren uitgevoerd met schuine pincet. In beide beelden ontaardt myeline profielen zijn gemarkeerd met pijlpunten. In paneel C pijlen geven voorbeelden van bewaard gebleven myeline profielen en een cluster van gespaard axonen. Schaalstaaf is 10 pm.
Figuur 3 hele berg spieren schematische en representatieve NMS AC:.. Gerenderde beelden van de EDL (A), peroneus longus (B), en de soleus (C) spieren na het verwijderen van de achterste ledematen. Getoond Spieren zijn van rechts achterste ledematen. Knie en enkel anatomische oriëntatie zijn ook opgenomen als referentie. Pezen zijn gekleurd wit en beschreven in een stevige zwarte lijn wanneer het zich op de top van de spier. Zij worden beschreven in een zwart streeplijn wanneer zij zich uitstrekken onder de spier. Delen worden in rood stippellijnen.Spier afgepeld van zaagvlakken, zoals aangegeven door pijlen blauwe en vervolgens verdund. Na verdunning, wordt de spier gescheiden van de pinnen door te snijden rond wat overblijft van de gespeld pezen DF:. Gerenderde beelden van hele berg spieren na verwijdering van het bindweefsel en de daaropvolgende dunner. De eindplaat banden worden uiteengezet op elke spier GH:. Soleus hele berg spieren veertien dagen na heupzenuw verliefd demonstreren opnieuw geïnnerveerde (G) en gedenerveerde (H) neuromusculaire juncties. In deze panelen, NMS, axonen, en Schwann-cellen worden gevisualiseerd, zoals hierboven in paragraaf 5.5.1 beschreven. Acetylcholine receptoren zijn rood, axonen groen en Schwann cel verwerkt blauw. In paneel G, de pijlen geven aan delen van de NMJ die zijn opnieuw gestimuleerd door een axon. In paneel H pijlpunten geven GAP-43 positieve Schwann cel processen. Let op de afwezigheid van axonen. Schaalstaaf is 10 pm.