Reproduceerbare Mouse heupzenuw Crush en de daaropvolgende beoordeling van Regeneratie door Whole Mount Muscle Analyse

Summary

In dit rapport beschrijven we een methode om de muis heupzenuw te verpletteren. Deze methode maakt gebruik van direct beschikbaar hemostatische tang en gemakkelijk en reproduceerbaar maakt complete heupzenuw crush. Daarnaast beschrijven we een methode om de spieren hele mounts geschikt voor analyse van de zenuw regeneratie na heupzenuw verliefd te bereiden.

Abstract

Regeneratie van het perifere zenuwstelsel (PNS) wordt op grote schaal onderzocht, zowel voor de relevantie ervan voor de menselijke ziekte en de robuuste regeneratieve respons gemonteerd door PNS neuronen daarmee mogelijk het verlichten van de mislukkingen van CNS regeneratie ¹ te begrijpen. Heupzenuw Crush (axonotmesis) is een van de meest voorkomende modellen van perifere zenuwschade bij knaagdieren ^2. Breken onderbreekt alle axonen, maar Schwann cel basale laminae worden bewaard, zodat de regeneratie optimaal is ^3,4. Hierdoor kan de onderzoeker nauwkeurig onderzoek het vermogen van een toenemende axon interactie met zowel de Schwann cel basale lamellen ^4. Ratten zijn over het algemeen de voorkeur diermodellen voor experimentele zenuw crush. Ze zijn op grote schaal beschikbaar en hun gelaedeerde heupzenuw biedt een redelijke benadering van de menselijke zenuwletsels ^5,4. Hoewel kleiner in omvang dan de rat zenuw, de muis zenuw heeft vele gelijkaardige kwaliteiten. Het belangrijkste is echter, mouse modellen zijn steeds waardevoller vanwege de ruime beschikbaarheid van transgene lijnen maakt het nu mogelijk voor een gedetailleerde dissectie van de individuele moleculen van cruciaal belang voor zenuwregeneratie ^{6, 7.} Voorafgaand onderzoekers gebruik hebben gemaakt van verschillende methoden om een zenuw drukken of letsel, met inbegrip eenvoudige schuine pincet, gekoeld tang, hemostatische tang, vasculaire klemmen en onderzoeker ontworpen klemmen ^8,9,10,11,12 te produceren. Onderzoekers hebben ook gebruik gemaakt van verschillende methoden voor het markeren van de schade site met inbegrip van hechtdraad, carbon deeltjes en fluorescerende kralen ^13,14,1. We beschrijven onze methode om een ​​reproduceerbaar volledige heupzenuw verliefd te verkrijgen met nauwkeurige en blijvende markering van de crush-site met behulp van een fijne hemostatische tang en de daaropvolgende koolstof crush-locatie markering. Als onderdeel van onze beschrijving van de nervus ischiadicus verliefd procedure die wij hebben ook een relatief eenvoudige methode om de spieren geheel te monteren die we gebruiken om vervolgens te kwantificeren regeneratie.

Protocol

1. Animal Onderwerpen

1.1. Behandeling

1. Alle dierlijke procedures dienen te worden uitgevoerd met toestemming van Animal van de lokale instelling Zorg en ethische commissie en in overeenstemming met het gebruik en het Comite en de National Institutes of Health richtlijnen, met maatregelen die zijn genomen om pijn en ongemak te minimaliseren.
2. Onze muizen werden gehuisvest in een temperatuur-gecontroleerde omstandigheden op een 12-uurs omgekeerde licht en donker cyclus, terwijl gevoed muis chow en water ad libitum.
3. Voor onderzoeken bij volwassen regeneratie, moet muizen minimaal 6 weken oud zijn als de heupzenuw v....

Discussion

Wij hebben voorgesteld een methode om een ​​betrouwbaar volledige heupzenuw verliefd te verkrijgen met precieze aanduiding van de crush site. Zoals eerder vermeld, heupzenuw verliefdheid is een gemeenschappelijke model voor de perifere zenuwschade bij muizen en ratten. Hoewel elke methode van verliefdheid heeft zijn voor-en nadelen, vonden we deze methode leverde een compleet verliefd die gemakkelijk werd gemarkeerd met een minimum van speciale apparatuur (bv. speciale klemmen, etc).

Crush Meth.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam (beschrijving / hoeveelheid)	Leverancier	Catalogus nummer
Mini Clipper met nr. 0000 Blade	Roboz	RC-5903
Nair Hair Remover (9 oz.)	Kerk en Dwight Co, Inc	N / A
Betadine Chirurgische Scrub (1 gallon)	Fisher Scientific	19066452
Oogzalf (1 oz.)	Fisher Scientific	19082795

Naam (beschrijving / hoeveelheid)	Leverancier	Catalogus nummer
FST 250 Hot kraal sterilisator	Fine Science Tools	18000-45
Iris Schaar (11 cm lang)	Wereld Precision Instruments	500216
Potts-Smith pincet (recht, 18cm, 1x2 Tanden)	Fine Science Tools	11024-18
McPherson-Vannas Schaar (5 mm bladen)	Wereld Precision Instruments	14124-G
Dumont # 5 Pincetten - Dumoxel Standard Tip	Fine Science Tools	11252-30
Dumont # 5/45 Pincetten - Dumoxel Standard Tip	Fine Science Tools	11251-35
Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth binnenkant)	Fine Science Tools	13020-12
Poedervormige actieve kool (500 g)	Fisher Scientific	C272-500
Maat 6-0 hechtingen met C-1 Naald (steriel, Zijde, Zwart, Gevlochten,Niet-absorbeerbare, 18 "Lengte, Doos van 36)	Roboz	SUT-1073/11
Reflex Clip Applier (voor 9 mm clips)	Wereld Precision Instruments	500345
9mm RVS Reflex Clips (100/doos)	Wereld Precision Instruments	500346

Naam (beschrijving / hoeveelheid)	Leverancier	Catalogus nummer
0,9% natriumchloride voor injectie (vrij van conserveringsmiddelen, 20 ml)	Hospira	0409-4888-20
Compleet Homeothermic Deken systeem met flexibele sonde (Medium, 115 V AC, 60 Hz)	Harvard Apparatuur	507222F

Naam (beschrijving /)	Hoeveelheid
Stainless Steel Platform (gemalen, ~ 12 "x12" x1 / 8 ")	1
Button Magneten (Voorbeeld: Eclipse E825)	3
Roestvrij stalen bouten (3 "Long; Diameter wordt bepaald door Button Magneten)	3
RVS Moeren (Sized tot Bouten Fit)	9
Rubber Bands (lichte spanning)	3
Insect Pins (Both Ends gebogen haken te vormen)	3

Naam (beschrijving / hoeveelheid)	Leverancier </ Strong>	Catalogus nummer
Paraformaldehyde (1 kg)	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
Dibasisch Watervrij (500 g; gebruikt om fosfaatbuffer Bereid)	Fisher Scientific	S375-500
Monobasisch Watervrij (1 kg, gebruikt om fosfaatbuffer Bereid)	Fisher Scientific	AC38987-0010
Glutaaraldehyde (50%, 10 x 10 mL)	Ted Pella, Inc	18431
Osmiumtetroxide (4% waterige, 10 x 10 mL)	Ted Pella, Inc	18465
Propyleenoxide (450 ml)	Ted Pella, Inc	18601
Embed 812 (Kit, voor harde blokken / beeld met hoog contrast)	Elektronen Microscopie Wetenschappen	14120
Toluidine Blue (25 g)	Ted Pella, Inc	19451

Naam (beschrijving / hoeveelheid)	Leverancier	Catalogus nummer
Paraformaldehyde (1 kg)	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
Dibasisch Watervrij (500 g; gebruikt om fosfaatbuffer Bereid)	Fisher Scientific	S375-500
Monobasisch Watervrij (1 kg, gebruikt om fosfaatbuffer Bereid)	Fisher Scientific	AC38987-0010
10% BSA oplosmiddel / blokkeeroplossing (200 ml)	Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc	50-61-00
Triton X-100 (100 ml)	Dot Wetenschappelijke Incorporated	9002-93-1
Glycine, 98% (1 kg)	Fisher Scientific	AC12007-0010
Tissue-Tek Cryo-OKT Compound (arrest van 12, 4 ml flessen)	Fisher Scientific	14-373-65
Sylgard DOW 170 (2 pond Kit)	Fisher Scientific	NC9492579
Roestvrij staal Insect Pins, Maat 1 (100/pkg)	Fine Science Tools	26001-40
Tetramethylrodamine-A-Bungarotoxin (0,5 mg)	Sigma-Aldrich	T0195-.5MG
Muize-monoclonaal antilichaam tegen SMI-312 (0,1 ml)	Covance	SMI-312R
Muize-monoclonaal antilichaam tegen SV2 (0,1 ml)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	SV2
Konijn Polyklonale antistof tegen GAP-43	Novus Biologicals	NB300-143
Flourescein geconjugeerd geit anti-muis IgG, Fcγ Subklasse 1 Specifieke	Jackson ImmunoResearch	11 5-095-205
DyLight 649 geconjugeerd ezel anti-konijn IgG	Jackson ImmunoResearch	711-495-152
4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, dilactate, 10 mg)	Invitrogen	D3571
Vectashield Montage Medium (10 ml)	Vector Laboratories	H-1000
Superfrost Plus Microscope Slides (wit, formaat: 75 x 25 mm; pak van 144)	Fisher Scientific	12-550-15
Fisherfinest Premium Cover Bril (Afmetingen: 40 x 22 mm, verpakking van 1 oz.)	Fisher Scientific	12-548-5C