Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Samenvatting

We hebben geoptimaliseerd een micro-inkapseling techniek als een effectief 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van embryonale stamcellen endoderm en dopaminerge (DA) neuronen. Het biedt ook een kans voor immuun-isolatie van cellen van de gastheer tijdens de transplantatie. Dit platform kan worden aangepast voor andere celtypen.

Samenvatting

Menselijke embryonale stamcellen (hESC) zijn in opkomst als een aantrekkelijk alternatief voor cel-therapie omdat ze kunnen worden uitgebreid in cultuur voor onbepaalde tijd en gedifferentieerd om alle soorten cellen in het lichaam. Verschillende soorten van biomaterialen zijn ook gebruikt stamcellen culturen een micro nabootsen van de stamcel nis ^1-3 geven. Dit laatste is belangrijk voor het bevorderen van cel-cel interacties, cel proliferatie en differentiatie in specifieke afstammingslijnen als weefsel organisatie door een driedimensionale (3D) omgeving ⁴ zoals inkapseling. Het principe van de cel inkapseling omvat beknelling van levende cellen binnen de grenzen van semi-permeabele membranen in 3D culturen ^2. Deze membranen voor de uitwisseling van voedingsstoffen en zuurstof stimuli over de membranen, terwijl antilichamen en immuuncellen van de gastheer die groter zijn dan de capsule poriegrootte uitgesloten ^5. Hier wordt voorafstuurde een benadering van cultuur en te differentiëren hESC DA neuronen in een 3D micro-omgeving met behulp van alginaat microcapsules. We hebben gewijzigd de kweekomstandigheden ² tot en met de levensvatbaarheid van ingekapselde hESC te verbeteren. We hebben eerder aangetoond dat de toevoeging van p160-Rho-geassocieerde coiled-coil kinase (ROCK) remmer, Y-27632 en menselijke foetale fibroblast-geconditioneerd serum vervanging medium (HFF-CM) om het 3D-platform aanzienlijk verbeterd de leefbaarheid van ingekapselde hESC waarbij de cellen uitgedrukt definitieve endoderm merkergenen ^1. We hebben nu gebruik gemaakt van deze 3D-platform voor de verspreiding van hESC en efficiënte differentiatie naar DA neuronen. Eiwit en genexpressie analyses na de laatste fase van de DA neuronale differentiatie toonde een verhoogde expressie van tyrosine hydroxylase (TH), een marker voor DA neuronen,> 100 plooien na 2 weken. Onze hypothese was dat onze 3D-platform met behulp van alginaat microcapsules kan nuttig zijn om de proliferatie te bestuderen en gericht differentiatievan hESC naar verschillende geslachten. Deze 3D Tegelijkertijd kan de scheiding van feeder cellen hESC tijdens het proces van differentiatie en ook mogelijke immuun-isolatie tijdens transplantatie in de toekomst.

Protocol

Alle van de onderstaande procedures worden uitgevoerd met behulp van aseptische technieken in een klasse II bioveiligheid kabinet. Reagentia en apparatuur zijn vermeld in de onderstaande tabellen.

1. Bereiding van 1,1% alginaat (w / v)

1. Voeg 0,275 g gezuiverd natriumalginaat (hoog gehalte glucuronzuur ≥ 60%, viscositeit> 200 mPa s, en endotoxine ≤ 100 EU / g) in een steriele 50 ml buis en voeg 25 ml steriele 0,1% gelatine oplossing eerder bereid (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H ₂ O en opgelost door autoclaveren).
2. Vortex de buis gedurende ongeveer 30 seconden om gedeeltelijke ontbinding van de alginaat poeder ....

Discussie

Verschillende studies met behulp van muis embryonale stamcellen en hESC hebben aangetoond dat de voordelen van 3D-cultuur systeem in biomaterialen en tissue engineering ^2,3. We calciumalginaat microcapsules gebruikt als geschikt 3D platform hESC vermeerdering en differentiatie te bestuderen in vergelijking met barium alginaat omdat hESC lieten een significant verhoogde levensvatbaarheid als ingekapseld in calciumalginaat dan barium alginaat. Deze cultuur-systeem maakt het ook mogelijk een high-density celkwee.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alginaat (Pronova UP MVG)	NovoMatrix	4200101	hoge glucuronzuur gehalte ≥ 60%, viscositeit> 200 mPa s, en endotoxine <100 EU / g
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
0,9% NaCl	Baxter Healthcare	AHF7123
Type J1 kraal generator	Nisco techniek Inc	SPA-0447
Multi-Phaser injectiepomp	New Era Pump Systems Inc	Model NE-1000
Ezi-Flow Medical Flowmeter	Gascon Systems	G0149
Y-27632	Merck	688000
Humaan serum albumine	Sigma-Aldrich	A4327-1G
Accutase	Millipore	SCR005
14G x 2 "IV katheter	Terumo	SR-OX1451C
Knockout-DMEM	Invitrogen	10829-018	Voor SR medium (basale)
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	Voor SR medium (2 mM)
Knockout Serum Vervanging	Invitrogen	10828-028	Voor SR medium (20%)
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15070063	Voor SR medium (2,5 U / ml)
Insuline-transferrine-Selenium (ITS)	Invitrogen	41400045	Voor SR medium (1x)
β-mercapto	Invitrogen	21985-023	Voor SR medium (0,1 mm)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Voor SR medium (5 mM)
Glasgow Minimum Essential Medium	Invitrogen	11710035	Voor DA neurale differentiatie medium (basale)
Knockout Serum Vervanging	Invitrogen	10828-028	Voor DA neurale differentiatie medium (10%)
Natriumpyruvaat	Invitrogen	11360070	Voor DA neurale differentiatie medium (1 mM)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Voor DA nEural differentiatie medium (0,1 mm)
β-mercapto	Invitrogen	21985-023	Voor DA neurale differentiatie medium (0,1 mm)
Sonic Hedgehog (SHH)	R & D Systems	1314-SH-025/CF	Voor DA neurale differentiatie (100 ng / ml)
Fibroblast groeifactor 8 bis (FGF8a)	R & D Systems	4745-F8-050	Voor DA neurale differentiatie (100 ng / ml)