High and Low Throughput Schermen met wortelknobbelaaltjes Meloidogyne spp.</em

Samenvatting

Twee verschillende manieren om het scherm planten met wortelknobbelaaltjes worden beschreven. De beschreven benaderingen omvatten high-throughput schermen met nematoden in een niet-destructieve manier vergemakkelijkt het gebruik van deze planten in fokprogramma's.

Samenvatting

Wortelknobbelaaltjes (Meloidogyne geslacht) zijn obligate planten parasieten. Ze zijn extreem polyfaag en wordt beschouwd als een van de economisch meest belangrijkste parasitaire nematoden. De microscopische tweede fase van de juveniele (J2), een keer geruid in het ei, is de besmettelijke fase. De J2s uitkomen van de eieren, vrij kunnen bewegen in de bodem binnen een film van water, en zoek wortelpunten van geschikte plantensoorten. Na het penetreren van de plantenwortels, trekken ze naar de vasculaire cilinder waar ze stellen een voeding site en initiëren voeden met behulp van hun stiletten. De meercellige voeding Website bestaat uit verschillende vergrote multinucleaire cellen, genaamd 'giant cellen', die worden gevormd uit cellen die karyokinesis (herhaalde mitose) ondergingen zonder cytokinese. Naburige pericycluscellen delen en te vergroten in omvang die aanleiding geven tot een typisch gal of wortel knoop, de karakteristieke symptoom van root-knoop nematode infectie. Als voeding wordt gestart, J2s worden sedentair en VNdergo drie extra vervellingen te worden volwassenen. De volwassen vrouwelijke legt 150-250 eieren in een gelatine matrix op of onder het oppervlak van de wortel. Van de eieren nieuwe infectieuze J2s uitkomen en start een nieuwe cyclus. Het root-knoop nematode levenscyclus is voltooid in 4-6 weken bij 26-28 ° C.

Hier presenteren we de traditionele protocol voor planten, gekweekt in potten, met wortelknobbelaaltjes en twee methoden voor high-throughput testen infecteren. De eerste high-throughput methode wordt gebruikt voor planten met kleine zaden zoals tomaat, terwijl de tweede is voor planten met grote zaden zoals cowpea en gewone boon. Grote zaden te ondersteunen uitgebreide groei van zaailingen met een minimum aan voedingsstoffen supplement. De eerste high throughput assay gebruikt zaailingen gegroeid zand in trays in de tweede test planten gekweekt in zakken in de afwezigheid van de bodem. De groei van zaailingen zakje is gemaakt van een 15,5 x 12,5 cm papier lont, gevouwen op de top van een 2-cm-diep dal, waarin het zaad of de zaailing geplaatst te vormen. Depapier lont is opgenomen in een doorzichtig plastic zakje. Deze groei zakjes maken een directe observatie van de nematode infectie symptomen, vreten van de wortels en eieren massaproductie, onder het oppervlak van een transparant zakje. Beide methoden maken het gebruik van de afgeschermde planten na fenotypering voor kruisen of zaadproductie. Een bijkomend voordeel van het gebruik van groei zakjes de kleine ruimte nodig omdat zakken worden opgeslagen in plastic opknoping mappen aangebracht rekken.

Protocol

1. Tomaat Seedling De groei in potten en trays

1. Voor pot-testen, plant tomaat zaden in een pot in een organisch-rijke bodem, zoals Sunshine mix. Houd in een kas bij 22-28 ° C. Na de kieming, een keer bemesten per week met Miracle-Gro.
2. Ongeveer twee weken na het ontkiemen, op de twee true-bladstadium, individueel transplantatie de zaailingen in potten (10 cm diameter en 17 cm diep) gevuld met steriele grond met 90% zand en 10% organische mix. Voeg Osmocote slow-release meststof en in een kas bij 22-28 ° C te houden voor twee weken. Blijf planten een keer per week bemesten met Miracle-Gro.
3. Voor high-throughput-schermen, plantenzaden direct in trays in een zanderige bodem, bedek de lade met plasticfolie tot kieming en onderhouden zoals hierboven. Na de kieming, voeg Osmocote slow-release meststof en een keer per week bemesten met Miracle-Gro.

2. Cowpea De groei van Seedling Pouches

1. Seeds zijn ofwel gekiemd in een petrischaal, bekleed met verschillende lagen van Kimwipe papier, en overgebracht afzonderlijk te zakken of direct geplaatst in de krant groef van het zakje en ontkiemd.
2. Plaats de zakjes in een plastic opknoping map, twee per map, en leg de mappen in een rek in een verticale positie. Plaats het rooster in een gecontroleerde omgeving kamer op een temperatuur van 25-28 ° C en 16 uur licht / 8 uur donker cyclus. Rekken ook kunnen worden gehandhaafd in een kas, maar vereisen een folie of stevig papier deksel geplaatst over het rek aan beide zijden van de stengels, om kans op schimmel besmetting te verkleinen.
3. Water van de zakjes een of twee keer per dag met omgekeerde osmose water. Ongeveer 10 tot 14 dagen na het zaaien, wanneer voldoende wortelsysteem tertiaire wortelpuntjes heeft (figuur 1), de zaailingen klaar voor inoculatie.

3. Extractie van Nematode Eieren

Extractie van eGGS van geïnfecteerde wortels wordt gewijzigd in een protocol ontwikkeld door Hussey en Barker (1973).

1. Drie tot vier dagen voor nematode inoculatie, uitpakken root-knoop nematode eieren van besmette tomaten wortels. Voordat u begint met ei-extractie, grondig het werkgebied met warm water om besmetting te voorkomen. Ook wassen in heet water een blender, twee emmers, een gaas-ondersteuning, een rubberen hamer, drie zeven van 425, 90 en 25 pm diafragma, een maatcilinder en een schaar.
2. Stapel de zeven van boven naar beneden in de volgende volgorde: 425, 90 en 25 pm diafragma. De eieren worden opgevangen op de 25 urn zeef op de bodem. Zet de zeven van een gaas wordt ondersteund in een gootsteen. Zet een emmer onder het gaas om de run-through oplossing te verzamelen.
3. Snij de toppen van de geïnfecteerde planten (s), gebruikt als de bron van het inoculum en ontdoen. Verwijder voorzichtig de plant uit de pot. Was de wortels door dompelen in een plastic emmer vol met water. Spoel de wortels verder onder lopenstromend water totdat de bodemdeeltjes worden gewassen uit de buurt van de wortels.
4. Snijd de wortels met een schaar in kleine stukjes. Gooi de penwortel.
5. Zet de gehakte wortels een plant in een grote plastic potje met deksel toe net genoeg 10% bleekmiddel oplossing de wortels bedekken en de klep te sluiten.
6. Schud de pot die de wortels gedurende 2 minuten.
7. Open de pot en giet de wortels op de bovenste zeef en was met een slang verbonden aan een beslaan mondstuk. Was goed totdat al het bleekwater geur is verdwenen. Gebruik een hamer aan de zijkanten van de zeven tikken om te voorkomen verstopping van de zeef poriën.
8. Verwijder de bovenste zeef en spoel het puin op de tweede zeef.
9. Verwijder de tweede zeef en vang de fijne puin, waarvan de eieren, van de laatste zeef omvat. Met een zwakke stroom van een fles water, verplaatst het puin aan een kant van de zeef. Verzamel het puin en de eieren in een schone beker met een minimum hoeveelheid water.
10. Zeef eens te meer het water verzameld in deemmer door de 25 urn zeef alle eieren die zijn vrijgekomen verzamelen. Goed afspoelen met water en verzamelen in dezelfde beker.
11. Gooi de plantenresten uit de bovenste zeef en spoel grondig alle drie de zeven met water onder druk. Raak de mazen van de zeven als het kan de poriegrootte vervormen.

4. Uitkomen Nematode Eieren

1. Bekleed een schone metalen mand met een paar lagen Kimwipe papier passen op een glazen petrischaal. Laat een 1 cm afstand tussen de bodem van de korf en de schotel.
2. Giet de afgezogen nematode eieren op het papier in de draad mand. Voeg genoeg vloeistof, zodat de onderkant van de draadkorf het wateroppervlak raakt, maar niet in water ondergedompeld. Bedek de bovenkant met een plastic deksel.
3. Elke dag controleren op het water verdampen en voeg wat water in de petrischaal, zodat de bodem van de mand het water raakt. Hiermee wordt voorkomen dat de eieren uitdrogen.
4. Om de andere dag, het verzamelen van de water de J2s van de platen in een bekerglas bevat. Indien niet onmiddellijk gebruikt, beluchten de verzamelde inoculum bij kamertemperatuur met behulp van een lab luchttoevoer of lucht die door een aquarium pomp. Gebruik de beluchte inoculum binnen 2 dagen. J2s kan opgehaald worden bij het uitkomen zetten over een periode van 6-8 dagen.

5. Tomaat Wortel Infectie in potten of bakken en evaluatie van infectie

1. Gebruik drie monsters van de verzamelde nematoden het aantal J2s tellen in een dia of tellen schaal en bereken en bepaalt het gewenste volume voor inoculatie. Typisch 3000 J2s worden gebruikt per plant in potten en 500 J2s voor de planten in trays.
2. Roer het inoculum van een magnetische roerstaaf plaat op lage snelheid.
3. Voordat u enten van de planten, zorg ervoor dat de bodem is vochtig, maar niet te nat. Voor pot inenting, maken drie gaten van ongeveer een half-pot diepte in het zand rond elke tomaat wortelstelsel met een potlood (zie figuur 2 ). Inoculeer elke plant door het leveren van de J2s in de drie gaten met behulp van een pipet. Daarna, bedek de gaten.
4. Voor de high-throughput-schermen in bakken, gebruik dan een aangepaste gesloten tip naald met gaten aan de zijkanten vastgelijmd aan een 5-ml pipetpunt langs een pipetter (figuur 3) om de J2s te leveren in de bodem. Als alternatief kan nematoden worden geleverd in stap 5.3.
5. Houd de planten in een kas bij 24-27 ° C gedurende zes tot acht weken. Ga twee keer per maand bemesten met Miracle-Gro.
6. Voor de evaluatie van de infectie, verwijder voorzichtig de planten uit de potten en spoel de wortels (zoals beschreven in stap 3.3).
7. Vlekken op de ei massa's blauwe door onderdompeling de wortels in 1 mg / L erioglaucine, gedurende 15 minuten.
8. Spoel de wortels in het water en de evaluatie door het tellen van de gebrandschilderde ei massa's op de individuele wortelgestel. Een verlicht bureau vergrootglas kan worden gebruikt om te bepalen hoe het ei massa's.
9. Indien de afgeschermde planten nodig voor verdere genetic studies, niet knippen van de toppen voor het wassen van de wortels voor evaluatie. Na het kleuren en het tellen van het ei massa's, transplantatie de zaailingen in de organische bodem, zwaar snoeien de toppen om transpiratie te verminderen, en te onderhouden in een kas.

6. Cowpea Root Infectie in zakjes en evaluatie van infectie

1. Tel de nematode inoculum en roer op een magnetische roerplaat zoals eerder beschreven.
2. Verwijder de zakjes uit de opknoping mappen en leg ze op een horizontaal oppervlak. Enten in elk zakje met 1500 J2s in 5 ml. Til het plastic deksel van het zakje en verdeel de nematoden over het oppervlak van de wortels.
3. Houd de zakjes in een horizontale positie gedurende 24 uur na inoculatie, bedekt met donker papier aan het licht uit te sluiten, dan terug naar de opknoping mappen in de klimaatkast.
4. De planten water als nodig is, een of twee keer per dag, met halve kracht oplossing Hoagland's (Hoagland & Arnon, 1950; tabel 1 ) tot een antwoord op de meststof wordt waargenomen, meestal verbeterde blad vergroening en krachtiger scheutgroei. Meestal worden de planten water gegeven met de helft van sterkte Hoagland 3 dagen in een rij. Daarna houden de zakjes vochtig met water.
5. Ongeveer 30 dagen (variërend van 28-35 dagen) na inoculatie, trekken elk zakje met ongeveer 10-20 ml van 75 mg / L erioglaucine. Houd zakjes overstroomd met de kleurstof in een horizontale positie nacht.
6. Giet de zakjes en evalueren van het wortelstelsel door het tellen van het ei massa's onder een verlicht bureau vergrootglas.
7. Als de afgeschermde planten nodig zijn voor verder genetisch onderzoek of het fokken werk, trek de wortels van het papier, transplantatie in biologische grond in potten en in stand houden in een kas.

7. Representatieve resultaten

De juiste stadium van tomaten en cowpea planten nematode inoculaties van de twee beschreven systemen zijn weergegeven in de figuren1 en 2. Bovendien zijn voorbeelden van goed geïnfecteerd wortels van tomaten en cowpea figuren 4 en 5. Zoals in de meeste ziekteresistentie schermen, verdient het aanbeveling om ten minste 6-10 planten per genotype voor nematode inoculatie gebruiken om de gemiddelde infectie berekenen. Variatie in de nematode infectie tussen planten, van hetzelfde genotype, kan worden verminderd door op basis van uniforme omvang van de installatie en nauwkeurige hoeveelheid en de levering van inoculum.

Het gebruik van trays en groei zakjes maakt het screenen van honderden tot duizenden planten in een kleine groei van de ruimte. Groei zakjes ook zorgen voor een snelle en efficiënte niet-destructieve evaluatie van root-knoop nematode infecties zonder de noodzaak voor het wassen van wortels (figuur 4).

Figuur 1. Een twee weken oude cowpea plant die in een zakje en klaar voor root-knoop NEMATode inenting.

Figuur 2. Een drie weken oude tomatenplant klaar voor root-knoop nematode inenting.

Figuur 3. Een aangepaste naald en pipet gebruikt voor high-throughput inoculatie van nematoden. De onderkant van de naald werd afgesloten en drie reeksen gaten zijn geboord in de naald met een laserstraal. Vervolgens werd de gemodificeerde naald bevestigd op een 5 ml pipet.

Figuur 4. Een tomaat wortelstelsel die besmet zijn met wortelknobbelaaltjes.

Figuur 5. Een cowpea wortelstelsel met ei massa gekleurd met erioglaucine 30 dagen na inoculatie geteeld op28 ° C.

Discussie

Er zijn twee kritische stappen voor een succesvolle nematode scherm: de voorbereiding van een zeer besmettelijke inoculum en het gebruik van planten op de juiste ontwikkelingsstadium. Uitkomen snelheid van root-knoop nematode eieren is zeer variabel en varieert tussen de 5 - 50%. Daarom moeten, om een ​​optimaal niveau van Hatch en zeer besmettelijk J2s te verkrijgen, moet veel aandacht worden besteed aan de ei-extractie en broedeieren procedures. Eieren moeten worden blootgesteld aan bleekmiddel voor een minimale periode en bleekmiddel moet worden gespoeld goed uit vanaf de wortel mengsel. Bij het uitkomen van de eieren, moet de slurry die de eieren niet worden ondergedompeld in water. Bovendien morsen de eieren in de onderliggende petrischaal waarbij het gearceerde jonge verzameld. Een manier om voorkomen dat er de eieren tijdens het broedproces is niet rechtstreeks toe te voegen water aan de Kimwipe als het papier zou kunnen breken. In plaats daarvan direct toe te voegen het water naar de petrischaal.

Voor het beste resultaat, gebruik maken van vers uitgekomen J2s. Indien de hatch laag is en inoculum wordt kan J2s worden bewaard bij 15 ° C gedurende een langere periode. Verwarm de opgeslagen inoculum tot kamertemperatuur de nematoden vóór de inoculatie herleven. Echter niet de J2s gedurende lange tijd zelfs bij 15 ° C uitgehongerde J2s niet efficiënt infecteren.

Jonge zaailingen zijn de beste ontwikkelingsfase voor root-knoop nematode inenting. Echter, dit moet worden afgewogen tegen de vorming van een adequaat wortelgestel voldoende aantal wortelpunten als punten van binnenkomst voor de J2s. Optimale plantengroei voorwaarde is ook van cruciaal belang voor de schermen. Speciaal Vermijd over-water planten die geteeld in zakjes. Over ontwatering zakjes, zoals aangegeven door stilstaand water in de bodem van de zak kan schimmels bevorderen en verminderen wortel gezondheid.

Met beide assays verdere evaluatie van nematodeninfectie en berekening van het aantal eieren / wortelstelsel en eieren / gram fresh root kan worden uitgevoerd. Voor de tomaat testen, worden de individuele wortels gewogen en gewonnen eieren zoals beschreven voor inoculum voorbereiding (deel 3). Bij het verwerken van groot aantal van plantaardige monsters, kunnen individuele wortelsystemen worden losgeweekt met behulp van een blender voor ei-extractie. Het aantal eieren te tellen in ten minste drie monsters en de eieren / gram vers wortelstelsel berekend. Voor het zakje testen, wordt het wortelgestel trok het papier insert, gewogen, en eieren gewonnen.