We beschrijven een protocol dat toelaat om en kwantitatief beoordelen van de morfologie van de dendritische structuur van afzonderlijke Purkinje cellen gekweekt in organotypische cerebellum slice culturen. Dit protocol is bedoeld om studies te bevorderen over de mechanismen van Purkinje cel dendritische ontwikkeling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Purkinje-cellen zijn een aantrekkelijk modelsysteem voor het bestuderen van dendritische ontwikkeling, omdat ze een indrukwekkende dendritische boom die strikt gericht is in het sagittale vlak en ontwikkelt vooral in de postnatale periode bij kleine knaagdieren, 3. Bovendien zijn verschillende antilichamen beschikbaar die selectief en intensief label Purkinje cellen inclusief alle processen met anti-Calbindin D28K wordt de meest algemeen gebruikt. Voor het bekijken van dendrieten in levende cellen, muizen die EGFP selectief in Purkinje cellen 11 zijn verkrijgbaar via Jackson labs. Organotypische cerebellaire slice culturen cellen maken een eenvoudige experimentele manipulatie van Purkinje cell dendritische ontwikkeling, omdat de meeste van de dendritische uitbreiding van de Purkinje cel dendritische boom is eigenlijk die plaatsvinden tijdens de kweekperiode 4. We presenteren hier een korte, betrouwbare en gemakkelijke protocol voor het bekijken en analyseren van de dendritische morfologie van Purkinje cellen gekweekt in organotypic cerebellaire slice culturen. Voor vele doeleinden, een kwantitatieve evaluatie van de Purkinje cel dendritische structuur gewenst. Wij richten ons hier op twee parameters, dendritische boom grootte en tak point getallen, die kan snel en eenvoudig worden bepaald op basis van anti-calbindin lood cerebellaire slice culturen. Deze twee parameters leveren een betrouwbare en gevoelige maat voor veranderingen van de Purkinje cel dendritische boom. Het voorbeeld van behandelingen met de proteïne kinase C (PKC) activator PMA en de metabotrope glutamaat receptor 1 (mGluR1) we zien hoe verschillen in dendritische ontwikkeling gevisualiseerd en kwantitatief beoordeeld. De combinatie van de aanwezigheid van een uitgebreide dendritische boom selectieve en intense immunokleuring methoden organotypische slice culturen die de periode van dendritische groei en een muismodel bedekken met Purkinje celspecifieke EGFP expressie maken Purkinjecellen een krachtig modelsysteem voor het onthullen van de mechanismen van dendritische ontwikkeling.
Protocol
1. Het opzetten van Organotypische Cerebellaire slice culturen
Cerebellaire slice culturen zijn bereid uit postnatale dag 8 P (8) muis pups met de statische incubatie methode 10. In ons laboratorium gebruiken we B6CF1 muizen. In sommige experimenten eveneens transgene muizen gebruikt die selectief expressie EGFP in Purkinje cellen. De voorbereiding van slice culturen duurt ongeveer 30 minuten per muis pup, dat wil zeggen 3 uur voor een nest van 6 pups muis. Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming werkbank met gesteriliseerde chirurgische instrumenten.
- Het cerebellum van ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De methoden die hier staat te stellen Purkinje cel dendritische ontwikkeling te bestuderen in organotypische cerebellum slice culturen en Purkinje cel dendritische groei kwantitatief te evalueren door het meten van dendritische boom grootte en het aantal van dendritische tak punten. Natuurlijk een uitgebreide en verfijnde kwantitatieve analyse van Purkinje cell dendrieten mogelijk, bijv. door bepaling van totale dendritische lengte uitvoeren van een analyse Sholl of bepalen van de fractale afmeting van de dendritische b.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Animal experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen Richtlijn van de Raad van 24 november 1986 (86/609/EEG) en werden beoordeeld en toegestaan door de Zwitserse autoriteiten. De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Basel, Ministerie van biogeneeskunde, en de Zwitserse National Science Foundation (31003A-116624).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| Weefselkweek Voegt | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | De PICMORG50 wisselplaten hebben een lage rand en laat het bekijken van levende culturen in een microscoop |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Paardenserum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Forbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS) -3,5-dihydroxy-fenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti Neun, kloon A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Konijn anti-GFP | Abcam | Ab290 |
Referenties
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
