Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Summary

Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.

Abstract

Een kritische vaak beperkende stap het begrijpen van de werking van de gastheer en virale eiwitten is de identificatie van interactie cellulaire of viraal eiwit partners. Er zijn vele benaderingen die de identificatie van interagerende partners, waaronder de gist twee-hybride systeem, en pull-down assays met behulp van recombinante eiwitten en immunoprecipitatie van endogene eiwitten, gevolgd door massaspectrometrie identificatie ¹ mogelijk te maken. Recente studies hebben gewezen op het nut van dubbele affiniteit tag gemedieerde zuivering, in combinatie met twee specifieke elutie stappen in de identificatie van interagerende eiwitten. Deze aanpak, aangeduid als Tandem Affinity Purification (TAP), werd aanvankelijk gebruikt in gist ^2,3, maar meer recent is aangepast voor gebruik in zoogdiercellen ^4-8.

Als proof-of-concept hebben we een tandem affinity purification '(TAP) methode met behulp van de goed gekarakteriseerde eukaryote translatie-initiatie factorenTor eIF4E ^9,10. De cellulaire vertaling factor eIF4E is een cruciaal onderdeel van de cellulaire eIF4F complex betrokken bij cap-afhankelijke translatie initiatie ^10. De TAP-tag gebruikt in de huidige studie is opgebouwd uit twee Proteïne G-eenheden en een streptavidine bindend peptide gescheiden door een Tobacco Etch Virus (TEV) protease-splitsing volgorde. De TAP-tag gebruikt in de huidige studie is opgebouwd uit twee Proteïne G-eenheden en een streptavidine bindend peptide gescheiden door een Tobacco Etch Virus (TEV) protease-splitsing volgorde ^8. Om de behoefte aan het genereren van klonale cellijnen af ​​te zien, ontwikkelden we een snel systeem dat is gebaseerd op de expressie van het TAP-tag aas eiwit uit een episomaal onderhouden plasmide gebaseerd op pMEP4 (Invitrogen). Expressie van muizen gelabeld eIF4E uit dit plasmide werd gecontroleerd met behulp van de cadmiumchloride induceerbare metallothioneïne promotor.

Lysis van de expressie brengen en vervolgens affiniteitszuivering via binding aan rabbit IgG agarose, TEV protease-splitsing, de binding aan streptavidine verbonden agarose en de daarop volgende biotine elutie op de vele eiwitten die blijkbaar eigen aan de eIF4E pull-down (in vergelijking met cellijnen de uiting van de TAP-tag alleen te controleren). De identiteit van de eiwitten werden verkregen door verwijdering van de banden van 1D SDS-PAGE en daaropvolgende tandem massaspectrometrie. De geïdentificeerde componenten die onderdeel zijn van de bekende eIF4E bindende eiwitten eIF4G en 4EBP-1. Ook andere componenten van het complex eIF4F waarvan eIF4E een component geïdentificeerd namelijk eIF4A en Poly-A bindende eiwit. De mogelijkheid om niet alleen bekend directe binding partners en secundaire interagerende eiwitten, te identificeren benadrukt verder het nut van deze aanpak in de karakterisering van eiwitten van onbekende functie.

Protocol

1. Het genereren van cellijnen: pMEP4 transfectie / expressie

1. Transfecteren cellen met de pMEP4 expressievector en selecteer met 100 ug van hygromycine B / ml (Roche) totdat alle schijn-getransfecteerde cellen zijn gedood. De pMEP4 plasmide wordt episomaal dus gehandhaafd hoeft specifieke klonen te isoleren.
2. Cellen die de pMEP4 vector kan geïnduceerd worden door behandeling met 10 pM ₂ CdCl gedurende 16 uur. Expressie en induceerbaarheid worden bevestigd op kleine schaal voor de amplificatie van de cellijnen. De TAP-gelabeld eiwit kan gemakkelijk worden gedetecteerd als het eiwit G-domeinen te binden aan antilichamen van bijna alle soorten. Voor grootschalige zuiveringen meestal 10 samenvloeiing 175 cm ² flessen van cellen nodig zijn. Dit komt neer op ongeveer 2 X10 ⁸ tot expressie brengen.

2. Cellysaat bereiding

1. Schraap cellen in PBS en combineren in een 50 ml buis. Spin 1200 x gfen 5 minuten (dit resulteren in 2-3 ml gepakte cellen te beginnen, dat tot op ongeveer 1,5 ml na het wassen).
2. Was de cellen drie keer ijskoude PBS (50 ml per keer).
3. Lyseren cellen in 5 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% NP-40, 1,5 mM _MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM Na ₃ VO ₄ en proteaseremmers ). Let op: NaF, Na ₃ VO ₄ en protease-remmers dient te worden toegevoegd fris. Pipetteer op en neer 10 keer voordat hij gedurende 5 minuten op ijs. Spuit op en neer 5-10 keer met behulp van een stompe naald voor vertrek weer op ijs gedurende 5 minuten op ijs. Herhaal syringing en laat nog 5 minuten op ijs.
4. Twee keer vries-dooi het lysaat (vloeibare N ₂ / of droog ijs en ethanol). Sta niet toe dat monster tot meer dan 4 ° C te bereiken Opmerking: u kunt dit monster te bewaren bij -80 ° C tot je tijd hebt om te verwerken.
5. Aliquot monster in 1,5 ml buizen en verwijder unlysed cellen en debris door centrifugeren (10 minuten bij 4 ° C, 16.000 x g).
6. Recover supernatant, te combineren in een 15 ml Falcon buis en (optioneel) door een 0,45 pm filter passeren voordat u een 20 ul monster voor eiwitrendement kwantificering. Haal nog eens 50 ul aliquot voor verdere analyse (Voorbeeld 1).

3. Binding aan konijnen-IgG-agarose

(Opmerking: spins worden uitgevoerd bij 1200 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C gedurende 1 minuut, tenzij anders aangegeven)

1. Voorzichtig mengen het konijnen-IgG-agarose-oplossing (Sigma-Aldrich) door wervelen fles. Neem 380 ul van IgG agarose (met behulp van een verlaging van 1 ml pipet) en verwijder de scheepvaart / conserveermiddel oplossing door middel van centrifugeren gedurende 1 minuut. Was de agarose driemaal gekoeld lysis buffer (4 ° C) met centrifugeren te verduidelijken. De eindopbrengst van agarose moet 250 pi verpakte kralen zijn.
2. Voeg de gewist cellysaat van 2,6 (in een 15 ml falcon bade) het gewassen konijnen-IgG agarose Incubeer 3 uur (of overnacht) bij 4 ° C met een roterende menger.
3. Spin down van de agarose parels gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant voor verdere analyse (Voorbeeld 2). Opmerking: De TAP-gemerkte eiwit moet nu worden geassocieerd met de kralen.

4. TEV protease decollete

(Opmerking: spins worden uitgevoerd bij 1200 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 oC gedurende 1 minuut, tenzij anders aangegeven)

1. Was de konijnen-IgG agarose parels drie keer in gekoelde lysis buffer (4 ° C) met behulp van centrifugatie om duidelijk te maken (let op: de lysisbuffer mogen geen protease-remmers). Zorg ervoor dat u niet te verwijderen of kralen te verliezen tijdens het wassen stappen.
2. Was de korrels nog twee maal met TEV-protease-splitsingsplaats buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, en 0,2% NP-40) met centrifugeren te verduidelijken. Na de laatste wasbeurt verwijder zorgvuldig alle lipond per van de kralen.
3. Maak een TEV protease decollete mix, voor elk monster zijn 467,5 ul H ₂ O, 25 ui 20x TEV buffer (Invitrogen), 5 pi 0,1 M DTT en 2,5 pl (25 U) TEV Protease (Invitrogen). Voeg 500 pi van dit mengsel TEV splitsing elk monster van verpakte kralen en dragen de gehele mengsel aan een 1,7 ml pre-gesmeerd buis (Costar). Vóór incuberen verwijderen 30 pl aliquot voor verdere analyse (voorbeeld 3).
4. Overnacht incuberen de TEV protease reactie bij 4 ° C met een roterende menger. Merk op dat korte incubatie tijd kan worden afhankelijk van de aard van het lokaas eiwit en de toegankelijkheid van de TEV protease-splitsingsplaats, maar de minimale incubatietijd dient empirisch worden bepaald.

5. De binding aan geïmmobiliseerd streptavidine Plus kralen ULTRALINK

(Opmerking: spins worden uitgevoerd bij 1200 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C gedurende 1 minuut, tenzij anders aangegeven)

1. Centrifugeer de TEV splitsingsreactie met het konijnen-IgG agarose korrels gedurende 5 minuten bij 1200 x g (4 ° C). Verwijder een 20 ui monster van de geklaarde supernatant voor analyse (monster 4)
2. Breng de resterende supernatant (ongeveer 480 pi) op ​​een nieuwe 1,5 ml pre gesmeerd buis (Costar) en verlaat deze op ijs. Gooi deze supernatant - dit bevat uw TEV gesplitste aas eiwit en de bijbehorende eiwitten.
3. Voeg 500 ul van gekoelde lysis buffer (paragraaf 2.3) om de resterende konijnen-IgG agarose parels en resuspendeer. Centrifugeer dit mengsel aan de parels te verduidelijken alvorens de supernatant en combineren met die in stap 5.2. Laat deze buis op ijs (het moet bevatten nu ~ 980 ul van het monster).
4. Bewaar de konijnen-IgG agarose parels voor verdere analyse (Sample 5). Let op: als je dit monster op een SDS-PAGE gel (of western blot) het geeft veel achtergrondinformatie te wijten aan de aanwezigheid van de IgG zware en lichteketens.
5. Ondertussen voorzichtig resuspendeer de Ultralink Streptavidine Plus agarose parels (Pierce) geïmmobiliseerd door schudden de fles. Met behulp van een 200 ul pipetpunt met het einde cut, aliquot 70 ul van streptavidine korrels per monster in pre-gesmeerd 1,5 ml buizen en verwijder de scheepvaart / conserveermiddel oplossing door middel van centrifugeren. Opmerking: Deze kralen zijn erg klein en zo "duck-billed" of platte / smalle-ended tips kunnen gebruikt worden om kraal verlies te minimaliseren tijdens het wassen worden.
6. Was de streptavidine korrels driemaal gekoeld lysis buffer (4 ° C) met centrifugeren te verduidelijken. Dit moet vertrekken ongeveer 45-50 ul van verpakte kralen per buis.
7. Breng de TEV-protease-splitsingsplaats supernatant (de 980 pi monster van stap 5.3) van de buis met de gewassen streptavidine kralen en geïncubeerd 3 uur (of overnacht) bij 4 ° C met een roterende menger.
8. Spin down van de streptavidine kralen gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant voor verdere analyse (SamPLE 6). Was de streptavidine korrels driemaal gekoeld lysis buffer (4 ° C) met centrifugeren te verduidelijken. Na de laatste wasbeurt, verwijder zorgvuldig alle resterende wasbuffer.

6. Biotine elutie van de streptavidine bindend peptide en proteïne aas

(Opmerking: spins worden uitgevoerd bij 1200 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C gedurende 1 minuut, tenzij anders aangegeven)

1. Elueren gemerkte eiwitten van streptavidine kralen door toevoeging van 500 ul PBS: biotine (1 mM D-biotine) en incubatie bij 4 ° C gedurende 3 uur (of een nacht) met een roterende menger.
2. Spin down van de streptavidine kralen gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant naar een 1,5 ml pre-gesmeerd buis (Let op: dit is uw uiteindelijke steekproef / elutie (Sample 7).
3. Nog een 500 ul Biotine: PBS de resterende parels streptavidine en incuberen bij 4 ° C gedurende 2-3 uur (of een nacht) met een roterende menger.
4. Returf stap 6.2 en combineren de twee eluties (Sample 7). Deze laatste elutie worden opgeslagen bij -80 ° C.
5. Om de efficiëntie van de biotine elutie te beoordelen, bevriezen de resterende streptavidine kralen en kook later in SDS sample buffer (Sample 8) (aanbevelingen: LaneMarker 5x het verminderen van monsterbuffer van Fisher).

7. Eiwitconcentratie

1. De laatste eluaat (Voorbeeld 7) moet vóór de analyse worden geconcentreerd door de lage eiwitconcentratie en relatief hoge volume. Dit kan bereikt met een laag molecuulgewicht (<5 kDa) Vivaspin rotatie kolommen (Vivascience). Doel het volume ingedampt tot minder dan 100 ul. Dit laatste monster kan worden gekookt en opgeslagen in eiwitmonster buffer (aanbevelingen: LaneMarker 5x het verminderen van monsterbuffer van Fisher).

8. Analyse

1. Monsters 1-8 kunnen worden geanalyseerd met Western blot om de efficiëntie van slopen bepalen. Opmerking: De meeste secundaire antilichamen zalkruisreageren met Proteïne G domeinen van het fusie-eiwit, maar dit wordt verwijderd na TEV protease-splitsingsplaats.
2. Voorbeeld 7 kan geanalyseerd worden door 1D en 2D SDS-PAGE. Kleuring kan worden uitgevoerd met zilver of Coomassie (aanbevelingen: SilverQuest Silver kleuring en Colloïdaal Blue Coomassie kleuringskits van Invitrogen). Proteïne-identificatie kan worden uitgevoerd met behulp van massaspectrometrie.

9. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van 1D SDS-PAGE analyse van het elutie (Voorbeeld 7) van dit protocol naar bindingspartners van TAP gelabeld eIF4E identificeren wordt in figuur 2. Deze vertegenwoordiger gel weerspiegelt de complexe en rijke natuur van eIF4E interacties met andere eiwitten in de cel. Vergelijking met de negatieve controle ook in figuur 2 gegenereerd van een cellijn die alleen TAP tag illustreert de specificiteit van deze eIF4E pull-down lokaas. In dit geval 15% van het geconcentreerde uiteindelijke elutie (monster7) werd geanalyseerd door 1D SDS-PAGE met behulp van in de handel verkrijgbare prefab gradiënt gels alvorens te worden gekleurd met behulp van de Silverquest zilverkleuring kit van Invitrogen.

Typisch 50-85% van de resterende geconcentreerde laatste elutie (Sample 7) wordt geanalyseerd met colloïdaal Coomassie vlek (Invitrogen). Monsters (gelstukjes / bands) van de gehele rijbaan werd vervolgens geëxtraheerd en geanalyseerd door massa-spectrometrie.

Eiwitten die in de eIF4E pull-down werden gefilterd tegen de bindende partners uit de negatieve controle van niet-specifieke binding partners te identificeren. De geïdentificeerde laatste proteïnen met dit proces TAP labels eIF4E te zien in figuur 2, die representatief is voor de normale eiwitten geïdentificeerd met deze techniek. Daarnaast werden een aantal eIF3 subeenheden ook geïdentificeerd (gegevens niet getoond).

Figuur 1. Schematische voorstelling van detandem affiniteitszuivering procedure. De zes stap tandem affinity purification '(TAP)-protocol gaat genereren van cellijnen, cellysis, konijn IgG agarose immuno-precipitatie, TEV protease-splitsing, streptavidine kraal affiniteitszuivering en uiteindelijk biotine elutie.

Figuur 2. Tandem affiniteitszuivering van de muis eIF4E eiwit. Interactie partners van de N-terminaal TAP gelabeld eIF4E werden gezuiverd van eukaryotische HEK293 cellen met behulp van de bijgevoegde protocol. Een 20% deel van de uiteindelijke elutie (monster 7) werd geanalyseerd door SDS-PAGE op een geprefabriceerde 4-12% gradiënt gel (TAP eIF4E baan). Een equivalent analyse werd uitgevoerd voor de tag alleen (TAP laan). Eiwitten werden geïdentificeerd met behulp van zilverkleuring. Eiwitten vervolgens geïdentificeerd door massa spectrometrie van hetzelfde monster worden gemarkeerd op deze gel.
Afkortingen: eIF4G; eukaryote translatie-initiatie facteur 4 gamma, PABP; polyA bindend eiwit, eIF4A: eukaryote translatie initiatie factor 4 letters, SBP-eIF4e, de overige TAP aas eiwit met de streptavidine bindende peptide gefuseerd met de eukaryote translatie-initiatie factor 4E, 4EBPs; eukaryote translatie initiatie factor 4E bindend eiwitten, eIF4eNiF1l eukaryote translatie initiatie factor 4E nucleaire import factor 1, SBP, de overige streptavidine bindend peptide van het TEV niet-gefuseerde TAP peptide.

Discussion

De TAP labelen techniek hier getoonde toont een zeer specifieke en strenge werkwijze voor het isoleren van de bindingspartners van lokaas eiwitten in eukaryote cellen. Deze benadering kan worden toegepast zowel cellulaire als virale eiwitten. Voor zover ons bekend, is dit de eerste keer dat een dergelijke techniek is toegepast op de translatie-initiatie factor eIF4E. Identificatie van de bekende eIF4E bindende eiwitten eIF4G en de 4EBPs gebruik van deze techniek bevestigt de geldigheid van een dergelijke aanpak. Bovendien is de identificatie van de resterende component van het complex eIF4F, namelijk eIF4A en PABP bevestigt dat onrechtstreekse interactie en tertiaire complexen intact blijven tijdens het zuiveringsproces. De identificatie van meerdere isovormen van de canonieke eIF4e bindende eiwitten was ook duidelijk. Deze zijn in detail beschreven in figuur 2.

Met betrekking tot de beperkingen van de aanpak, dienen bepaalde zorg worden ondernomen met betrekking tot de keuzeaas eiwit en of de TAG tag plaatsen op de N-of C-terminus. Het is misschien raadzaam om een ​​functionele test uitvoeren of de lokalisatie van het fusie-eiwit te onderzoeken door middel van microscopisch voorafgaand aan de full scale zuivering om ervoor te zorgen de gelabelde afgeleide functioneel is. Integraal membraan of nucleaire eiwitten kunnen niet zonder meer worden vrijgegeven door de relatief mild voorwaarden beschreven in de lysis stap. Zoals alle immunoprecipitaties en dergelijke pull-down assays kunnen wijzigingen worden aangebracht aan de aard en concentratie van het detergens in de lysisbuffer de efficiëntie van lysis te verhogen. De concentratie van de ionische lysis en wasbuffers kunnen ook worden gemodificeerd te verhogen of verlagen de stringentie van de zuivering. Het is ook mogelijk om de eerste zuivering onder standaard milde omstandigheden (hierboven beschreven) maar vervolgens verdelen streptavidine kralen (punt 5.8) in 4-5 aliquots, dat kan worden gewassen onder meer ionische conomstandigheden. Daardoor kunnen de gebruiker de optimale voorwaarden niet-specifieke interagerende eiwitten verwijderd identificeren. Het gehele proces kan uitgevoerd worden met transiënte transfectie waarbij de interactie partners zijn bekend en de aanwezigheid of afwezigheid bepaald door western blot na alleen. In dit geval zouden we suggereren twee 100cm ² gerechten van cellen elk getransfecteerd met 8 ng van expressie plasmide. Deze gewijzigde procedure is van bijzonder bij de behandeling van het vermogen van mutant derivaten van de TAP-fusie-eiwit interactie met bekende bindingspartners.

Analyseren monsters 1 tot en met 8 op zilver gekleurde SDS-PAGE gels (of western blot als een antilichaam aanwezig) is een goede manier problemen is de techniek niet acceptabele resultaten oplevert. De capaciteit van elke affiniteit gebaseerde neerslag en specifieke elutie kunnen worden geanalyseerd met deze systematische steekproefbenadering. Monsters een tot acht moeten worden genomen tijdens de optimisering van het protocol voor elk nieuw aas.

De TAP-tagging techniek biedt een krachtige en robuuste alternatief voor andere benaderingen, zoals GST pull-downs, gist twee-hybride testen, etc. De dubbele affiniteitszuivering en specifieke elutie stappen (TEV decollete en biotine elutie) specificiteit en strengheid te verstrekken aan worden gehandhaafd op een hoog gedurende de zuiveringsprocedure. Kritisch deze techniek kan worden toegepast op elk eiwit en derhalve een goede methode voor het identificeren bindingspartners voor een eiwit doel van belang.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
Hygromycine B	Roche	10843555001
Konijnen-IgG Agarose	Sigma	A2909
AC-TEV Protease	Invitrogen	12575-015
Proteaseremmer cocktail	Calbiochem	539134
Ultralink Geïmmobiliseerde Streptavidine Plus kralen	Doorboren	53116
Vivaspin 500 centrifugale concentrator (5KDa)	Vivaspin	V50112
SilverQuest zilverkleuring kit	Invitrogen	LC6070
Novex Colloïdaal Blue Coomassie vlekken kit	Invitrogen	LC6025
1.7ml smeermiddel behandelde buizen	Costar	3207
Microcapillaire pipettips	VWR	37001-150
NuPage 4-12% Bis-Tris gradiënt gels	Invitrogen	NP0322BOX
CdCl 2	Sigma	202908
5x SDS sample buffer	Visser	PN39000