Methodenartikel

Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door In Vivo Elektroporatie

DOI:

10.3791/3653

⸱

30 juni 2012

 ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Oregon Health & Science University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren een In de baarmoeder Genoverdracht techniek die bestaat uit drie stappen: de muis ventrale laparotomie, transuterine micro-injectie, en In vivo Elektroporatie. We maken gebruik van digitale video-microscopie om de kritische experimentele embryologische technieken te demonstreren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zoogdieren binnenoor heeft 6 verschillende sensorische epitheel: 3 cristae in de ampullen van de halfcirkelvormige kanalen, maculae in de utricle en sacculus, en het orgaan van Corti in de opgerolde slakkenhuis. De cristae en maculae bevatten vestibulaire haarcellen die transduceren mechanische stimuli om de speciale gevoel van evenwicht dienstig zijn, terwijl de auditieve haarcellen in het orgaan van Corti zijn de primaire transducers voor het horen van 1. Lot van de cel specificatie in deze sensorische epitheel en morfogenese van de halfcirkelvormige kanalen en het slakkenhuis vindt plaats tijdens de tweede week van de zwangerschap in de muis en zijn grotendeels voltooid voor de geboorte 2,3. Ontwikkelings-studies van de muis binnenoor worden routinematig uitgevoerd door het oogsten van transgene embryo's op verschillende embryonale of postnatale fase inzicht te krijgen in de moleculaire basis van cellulaire en / of morfologische fenotypes 4,5. Onze hypothese is dat genoverdracht naar de ontwikkelingslanden muis binnenoor in de baarmoeder </ Em> in het kader van de winst-en verlies-van-functie studies is een gratis benadering van de traditionele muis transgenese voor de ondervraging van de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan zoogdieren binnenoor ontwikkeling 6.

De experimentele paradigma om gen-misexpression studies uit te voeren in de ontwikkelingslanden muis binnenoor aangetoond hier is opgelost in drie algemene stappen: 1) ventrale laparotomie, 2) transuterine micro-injectie, en 3) in vivo elektroporatie. Ventrale laparotomie is een muis te overleven chirurgische techniek die uitbesteding van de baarmoeder toelaat te krijgen experimentele toegang tot de geïmplanteerde embryo's 7. Transuterine micro-injectie is het gebruik van schuine, glazen capillaire micropipetten tot expressie plasmide in het lumen van het otic blaasje of otocyst te introduceren. In vivo elektroporatie is de toepassing van blokgolf, gelijkstroom pulsen om de expressie plasmide rijden progenitorcellen 8-10.

11. Muis experimentele embryologische technieken kan het moeilijk zijn om te leren van proza ​​en foto's alleen. In dit werk, tonen we de 3 stappen in de genoverdracht procedure. De meeste kritisch, zetten we digitale video-microscopie om precies te laten zien hoe je: 1) het identificeren embryo oriëntatie in de baarmoeder; 2) embryo's te heroriënteren voor het richten van injecties langs de otocyst; 3) microinject DNA gemengd met kleurstof tracer oplossing in de otocyst op embryonale dag 11.5 en 12,5; 4) electroporate de ingespoten otocyst, en 5) label geëlektroporeerd embryo's voor postnatale selectie bij de geboorte. Wij bieden representatieve voorbeelden van succesvol getransfecteerd innerlijke oren, een geïllustreerde gids voor de meest voorkomende oorzaken van otocyst mistargeting, bespreken hoe de gemeenschappelijke methodologische fouten te vermijden, en de huidige richtlijnen voor het schrijven van een in de baarmoeder gENE overdracht verzorging van dieren protocol.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ventrale Laparotomie

  1. Verdoof een dam die als embryo in embryonale dag 11,5 (E11.5; uur op de dag een vaginale plug wordt gedetecteerd is dag 0.5 van de embryonale ontwikkeling) door intraperitoneale injectie van natrium-pentobarbital anestheticum (7,5 ul per gram lichaamsgewicht). Werken anestheticum: 180 pi van 50 mg / ml natriumpentobarbital oplossing, 100 pi absolute ethanol 320 pi van 65 mg / ml waterige magnesiumsulfaat (moduleert uterine toon) en 400 ul propyleenglycol (voertuig mengbaar met waterige en organische componenten).
  2. Beoordeel de volledigheid van de anesthesie door het uitvoeren van schadelijke stimuli tests: poot squeeze, staart knijpen, en knipperen antwoord op de wang en vibrissae touch. Breng een steriel oogzalf aan de hoornvliezen.
  3. Scheer de buik vacht van de suprapubische gebied om de ribbenkast met een schaar en een boete mes (Oster # 40 blad). Desinfecteren de buik met 70% ethanol, 10% povidonjood (Betadine), eennd 70% ethanol, na elkaar. Plaats de muis buik naar beneden op een steriel laken en vervolgens op een verwarmingselement of een warm bord (37 ° C) gedurende 2-5 minuten.
  4. Incisie de buikhuid in de ventrale middellijn met de bal-tip schaar. Verleng de incisie van 10-14 mm. Identificeer de linea alba, een avasculaire, wit bindweefsel band langs de ventrale middellijn van de buikwand. Incisie de linea alba met bal getipt schaar en uitbreiding van de incisie 10-14 mm. Onmiddellijk spoelen van de buik met voorverwarmde (37 ° C) Ringer's lactaat-oplossing.
  5. Externaliseren van de twee horens van de baarmoeder met ring pincet zonder te veel druk op de implantatie sites. Spoel de geëxternaliseerde baarmoederhoorns met voorverwarmde, lactaat Ringer's.

2. Micro-injectie Transuterine

  1. Vervaardig een dikwandige, borosilicaatglas capillaire micro-injectie pipet met de volgende kenmerken: 12-16 μm diameter en een 20 graden schuine kant. Op een Sutter P-97-pipet trekker met kleine doos filament, gebruikt u de volgende programma: warmte = helling-test plus 3 eenheden; druk = 200; trekken = 0; snelheid = 46; tijd = 100). Met de Sutter BV-10 beveler, gebruik maken van de 104C (goud) schuur schijf voor een grote diameter pipetten. Hersuspenderen expressieplasmide van 3-4 ng / ul in kalkvrij fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,2-7,4). Voeg kristallijne snel groen naar de geconcentreerde DNA, vortex gedurende 30 seconden voorzichtig, en draaien op 10.000 g gedurende 10 seconden. De minimale hoeveelheid snel groene nodig visueel volgen de werkzaamheid van de injectie wordt empirisch bepaald. Plantgat de schuine pipet met het DNA / snel groene oplossing. Sluit de geladen micro-injectie pipet om de pipet houder van de druk injector (Picospritzer met behulp van> 99% zuivere stikstof als bron gas).
  2. Transilluminate de baarmoeder met een lage intensiteit, halogeen licht om de embryo in de plaats van implantatie te visualiseren. Identificeer de beaTing hart, hersenen blaasjes, ledematen, ontluikende 4 e ventrikel van de achterhersenen, en in het oog. Spoel de baarmoeder om de 2 minuten met voorverwarmde, Ringer-Lactaat oplossing voor hydratatie te behouden. Pas lichte druk op de baarmoeder het embryo te heroriënteren en identificeren van de anatomische oriëntatiepunten zoals hierboven vermeld.
  3. Orient het embryo naar de primaire hoofd ader die anterieure en posterieure takken flank van de mesenchymale grondgebied waarop de otocyst woont te identificeren. De otocyst juiste kan niet gezien worden door transilluminatie van de baarmoeder. De otocyst ligt halverwege tussen de voorste en achterste takken van de schoolleiders in het primair ader, die samen met de belangrijkste stam van de ader, vormen de vorm van de staanders of doelpalen op een American football veld. De otocyst houdt het midden tussen de staanders.
  4. Plaats de injectie pipet door de baarmoeder in een traject in lijn met de vermoedelijke locatie van de otocyst. Een keer Pulse de microinjector na het passeren van de Uterons naar de tracer kleurstof en de onderlinge aanpassing van de locatie van de pipetpunt te visualiseren. Advance de pipet onder micrometer controle en pulseren weer de diepte te beoordelen. Verder is de pipet herhaaldelijk vooruit in de laterale kop mesenchym en pols. Succesvolle otocyst targeting zal onthullen de conische vorm van de endolymfatische kanaal dorsaal en de schelp-vorm van de vestibule. Laat de druk op de baarmoeder, de pipet uit het embryo / de baarmoeder in een beweging, en meteen de baarmoeder spoelen met een voorverwarmde, Ringer-oplossing.

3. In vivo elektroporatie

  1. Spoel de baarmoeder met Ringer's lactaat. Vers aangebrachte lactaatbevattende Ringer-oplossing nodig is om elektrisch koppelen van de paddle-style elektroden naar de baarmoeder. Bevochtigen wolfraam oppervlakken van de elektroden met Ringerlactaat. Center de geïnjecteerde otocyst in de baan van de elektroden. Voorzichtig te comprimeren de baarmoeder met de elektroporatie paddles. De kathode in contact met de uteruswand dwars op de geïnjecteerde otocyst en de anode in aanraking met de uteruswand naast de geïnjecteerde otocyst. Activeer een blokgolf trein met het voetpedaal schakelaar op de electroporator. Elektroporatie parameters zijn: 5, 50 msec pulsen op 43 volt per impuls en een 950 msec interpuls vertraging. Onmiddellijk spoelen de baarmoeder na de puls trein wordt geleverd. Noteer de stroom geleverd aan het weefsel: 60-100 mAmps is voldoende om otic epitheliale voorlopercellen transfecteren. Injecteer en electroporate 4-6, E11.5 embryo's per dam.
  2. Voer een tweede onafhankelijke transuterine microinjectie waterige fluorescerende dextran (Alexa Fluor 488 als de expressie plasmide codeert voor een rood fluorescent eiwit of Alex Fluor 594 als de expressie plasmide codeert voor een groen fluorescent eiwit) in de 4e ventrikel van de embryo's die binnen oren nauwkeurig geïnjecteerd en ten minste 60 mAmps van stroom per puls was deovergegeven tijdens elektroporatie. De fluorescerende dextran zal detecteerbaar zijn bij de geboorte in de achterhersenen en maken de selectie van pups waarvan de innerlijke oren waren gemanipuleerd tijdens de embryogenese (zie 3.5).
  3. Spoel de baarmoederhoorns met Ringer's lactaat. Plaats de baarmoederhoorns in de buikholte. Spoel de baarmoederholte met 2-4 ml voorverwarmde, lactaat Ringer's en laat de overloop uit de afvoer van de incisie op het steriele laken. Vervang de draperen met droge, steriele materiaal. Hecht de buikwand met een niet-snijdende naald en een 6-0 resorbeerbaar hechtdraad. Wij geven de voorkeur een lopende steek, blokkeren elke andere steek, voor zowel de buikwand en de huid.
  4. Droog de dammen 'bont en het beheer van een niet-steroïdale anti-inflammatoire, zoals Meloxicam via subcutane injectie. Zet de moeder van de voorverwarmde herstel kooi op een steriel laken. Controleren en vastleggen van de dammen 'ademhaling, incisie doorgankelijkheid, en de vagina voor de bloederige afscheiding. Bloeding is raopnieuw, maar indien aanwezig en onverminderd door, euthanaseren de dam, terwijl ze nog onder narcose. Let op de tijd dat ze terug bij bewustzijn en pogingen om ambulate. Zet de dam om de muis te kolonie toen ze tekenen van eten en drinken en is begonnen met nest te bouwen. Meestal gebeurt dit binnen 12 uur.
  5. Bij de geboorte (postnatale dag 0), flitser van de achterhersenen gebied van elke pup in het nest om de tl-dextran met een stereofluorescence stereomicroscoop met een GFP of Texas Red-filter te detecteren, wordt voldaan. Terug naar de zogende moeder alleen die pups die achterhersenen etikettering weer te geven.

4. Representatieve resultaten

figure-protocol-1
Figuur 1. Elektroporatie-gemedieerde genoverdracht ontwikkeling slakkenhuis. De E11.5 otocyst werd geïnjecteerd met een expressieplasmide dat codeert versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) en geëlektroporeerd (puls train de parameters: vijf, 43 volt pulsen op 50 msec / puls en 950 msec interpuls vertraging). A) Een vertegenwoordiger binnenoor van een postnatale dag 6 (P6) pup die otocyst werd geïnjecteerd en geëlektroporeerd op E11.5 demonstreren EGFP expressie van de basis door het midden begin van het slakkenhuis. De zijwand van het slakkenhuis werd uit het midden turn en apex alleen. E11.5 voorlopercellen die aanleiding geven tot de top niet getransfecteerd. B) Het hele mount immunokleuring van het slakkenhuis in (A) met de haarcel marker, myosine 7a (Myo7a), geeft aan dat EGFP expressie volgt het traject van het orgaan van Corti en is schromelijk gelokaliseerd om het haar cel-dragende sensorische epitheel. C) Een vertegenwoordiger binnenoor van een E18.5 embryo waarvan otocyst werd geïnjecteerd en geëlektroporeerd op E11.5. De laser confocale projectie toont EGFP expressie in Myo7a-positieve haarcellen. D) Laser confocale projectie van het cochleair sensorische epitheel van de E18.5 orgaan van Corti met vermelding van EGFP expression in de binnenste haarcellen (IHC), buitenste haarcellen (OHC), innerlijke phalangial cellen (IPC), pijler cellen (pc), en Deiters 'cellen (DC). De schaalstaaf in (B) geldt (A).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gene transfer naar de ontwikkeling van de muis binnenoor: De muis binnenoor ontwikkelt zich vanaf de otic placode tijdens de eerste week van postimplantatie ontwikkeling 12,13. Door embryonale dag 9.5 (E9.5), heeft de placode geïnvagineerde en veranderd in een met vloeistof gevulde blaasjes genoemd otocyst 2. Otic voorlopers in het blaasje aanleiding geven tot de zintuiglijke en nonsensory cellen in het volwassen binnenoor en de neuronen die mechanisch gevoelige haarcellen innerver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Humana Press om toestemming om de micro-injectie pipet fabricage cijfer dat oorspronkelijk verscheen op pagina 130 van referentie 11 te publiceren; Larry Dlugas en Steven Wong, OHSU Department of Educational Communications, voor videografie, Larry Dlugas voor video-ontwerp en-bewerking; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco voor het ontwerpen van onze op maat horizontale laminaire stroming kap en Les Goldsmith voor het verstrekken van de technische schema, Victor Monterroso, MV, MS, PhD en Tom Chatkupt, DVM, OHSU Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde, voor informatie met onze verzorging van dieren protocol, chirurgische technieken, en profylactische analgesie regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, voor het delen van zijn hand-out inzake veterinaire hechten technieken; Edward Porsov, MS, voor het ontwerpen van onze Adobe Premiere Pro video-microscopie computerwerkplek, en Leah Wit en Jonas Hinckley van LNS Captioning (Portland, OR). Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute on Doofheid en Other Communicatie aandoeningen: DC R01 008595 en DC R01 008595-04S2 (naar JB) en P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Micro steriliseren zaak ROBOZ RS-9900a 8X8.5X1.25 inch
Ball-tip schaar Fine Science Tools 14109-09
Ring tang Fine Science Tools 11106-09 4,8 mm ID/6mm OD
Adson Tissue tang Fine Science Tools 11027-12
Naald driver Fine Science Tools 12502-12
Allergie Spuit lade Becton Dickison 305536
Suture 6-0 Syneture GL-889 0,7 metrische gastro-intestinale hechtdraad
Ringer-lactaat-oplossing voor injectie USP Baxter 2B2323
Snel groen Sigma Aldrich F7258
Borosilicaatglas capillaire Harvard Apparatuur 30-0053
Nembutal Natrium oplossing OVATION Pharmaceuticals Inc NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Propyleenglycol Fisher Scientific P355-1
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Micropipet Puller Sutter Instrumenten P-97 FB255B box gloeidraad; raadplegen Pipetteer Kookboek van Sutter instrumenten
Micro-elektrode Beveler Sutter Instrumenten BV-10 104C afschuining schijf voor grote pipetten, raadpleeg de handleiding voor het afschuinen van de theorie
Micropipet houder Warner Instruments MP-S15T Voor 1,5 mm buitendiameter pipet en vrouwelijke druk poort voor Picospritzer buizen.
Pincet-stijl elektrode Protech International Inc CUY650P5 5 mm buitendiameter
Square Wave Electroporator Protech International Inc CUY21EDIT Voetpedaal aanbevolen
PICOSPRITZER III Parker Hannifin 051-0500-900 Voetpedaal aanbevolen
Handmatige bediening micromanipulator Harvard Apparatuur 640056
Horizontale laminaire stroming schone werkbank Envirco Custom aanpassingen aan LF 630-10554. Zie aanvullende informatie voor de kap schema.
Leica stereofluorescence ontleden van microscopie met Lumencor SOLA lichte motor Bartels en Stout en Lumencor MZ10F met Lumencor SOLA lichte motor Voetpedalen aan de MZ10F richten en aan de SOLA lichte motor te activeren worden aanbevolen
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml waterige
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml waterige
Enviro-dri Shepherd Specialty Papers www.ssponline.com

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
  3. Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
  4. Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
  5. Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
  6. Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
  7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
  9. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
  12. Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
  13. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
  14. Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
  15. Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
  16. Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
  17. Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46(2006).
  18. Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
  19. Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ventrale laparotomietransuteriene micro injectieinjectie in de otische vesikelembryonale dag 115gentransfertechniekpeddel elektrodenGFP expressieanalyseprotocol voor dierverzorging

Gerelateerde artikelen