Het karakteriseren van T-cel-epitopen van pathogenen die lokale infecties veroorzaken, zoals het humaan papillomavirus, is een uitdaging vanwege het beperkte aantal circulerende T-cellen. Er wordt een methode beschreven waarbij zeldzame T-cellen werden geïsoleerd en gekarakteriseerd, beginnend met een zeer klein aantal cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er is een protocol ontwikkeld om de moeilijkheden bij het isoleren en karakteriseren van zeldzame T-cellen te overwinnen die specifiek zijn voor pathogenen, zoals het humaan papillomavirus (HPV), die lokale infecties veroorzaken. De betrokken stappen zijn het identificeren van regio(s) van HPV-proteïnen die T-cel-epitoop(s) van een proefpersoon bevatten, het selecteren van peptide-specifieke T-cellen op basis van interferon-γ (IFN-γ) secretie, en het kweken en karakteriseren van de T-celklonen (Fig. 1). Proefpersoon 1 was een patiënt bij wie onlangs via biopsie een hooggradige platsel epitheeliale intraepitheliale laesie was vastgesteld en die op de dag van de T-celafname een loop electrical excision-procedure onderging voor de behandeling1. Een regio binnen de proteïnen E6 en E7 van het humaan papillomavirus type 16 (HPV 16) die een T-cel-epitoop bevatte, werd geïdentificeerd met behulp van een IFN-γ enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay uitgevoerd met overlappende synthetische peptiden (Fig. 2). De gegevens van deze assay werden niet alleen gebruikt om een regio met een T-cel-epitoop te identificeren, maar ook om het aantal epitoop-specifieke T-cellen te schatten en deze te isoleren op basis van IFN-γ secretie met behulp van commercieel beschikbare magnetische kralen (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). De geselecteerde IFN-γ secreterende T-cellen werden verdund en afzonderlijk gekweekt in aanwezigheid van een mengsel van bestraalde feeder-cellen om de groei van één enkele T-cel per putje te ondersteunen. Deze T-celklonen werden gescreend met een IFN-γ ELISPOT assay in aanwezigheid van peptiden die de geïdentificeerde regio dekken en autologe, door het Epstein-Barrvirus getransformeerde B-lymfoblastoïde cellen (LCLs, verkregen zoals beschreven door Walls en Crawford)2 om het aantal benodigde T-celklooncellen te minimaliseren. In plaats van de 1 x 105 cellen per putje die gewoonlijk in ELISPOT assays worden gebruikt1,3, werden 1.000 T-celklooncellen in aanwezigheid van 1 x 105 autologe LCLs gebruikt, wat het aantal benodigde T-celklooncellen drastisch verminderde. De autologe LCLs dienden niet alleen om peptide-antigenen aan de T-celklooncellen te presenteren, maar ook om een hoge celdichtheid in de putjes te behouden, waardoor de epitoop-specifieke T-celklooncellen IFN-γ konden secreteren. Dit waarborgt de succesvolle uitvoering van de IFN-γ ELISPOT assay. Op soortgelijke wijze werden IFN-γ ELISPOT assays gebruikt om de minimale en optimale aminozuursequentie van het CD8 T-cel-epitoop (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) en het HLA klasse I restrictie-element (B58) ervan te karakteriseren. De IFN-γ ELISPOT assay werd ook uitgevoerd met autologe LCLs geïnfecteerd met vacciniavirus dat HPV 16 E6 of E7 proteïne tot expressie bracht. Het resultaat demonstreerde dat het E6 T-cel-epitoop endogeen werd verwerkt. De kruisrecognitie van homologe T-cel-epitopen van andere risico-HPV-typen werd aangetoond. Deze methode kan ook worden gebruikt om CD4 T-cel-epitopen te beschrijven4.
Protocol
Door middel van een IFN-γ ELISPOT-assay met een CD8 T-cellijn die was gevestigd vanuit Subject 1, werd vastgesteld dat de regio 46-70 van HPV 16 E6 een T-cel-epitoop bevat1 (Fig. 2), en de epitoopspecifieke T-cellen werden geselecteerd op basis van IFN-γ secretie voorafgaand aan de start van dit protocol (Fig. 1).
1. Beperkende verdunning van epitoopspecifieke T-cellen
- Bereid het feeder-celmengsel voor door bestraalde (4.000 rad) allogene perifere bloedmononucleaire cellen (PBMCs) bij 5 x 105 cellen/ml, bestraalde (5.000 rad) allogene LCL's bij 5 x 104 cellen/ml en fytohemagglutinine (PHA) bij 0.1 μg/ml te combineren met behulp van compleet Yssel-medium dat 1% gepoold menselijk serum bevat. De cellen moeten gedurende het gehele protocol onder steriele omstandigheden worden gehanteerd.
- Verdun de geïsoleerde epitoop-specifieke T-cellen seriële (Fig. 3) met behulp van het feeder-celmengsel totdat de concentratie 0,5 cel/100 μl of 5 cellen/1 ml bereikt. Gebruik ongeveer 3 x 103 epitoop-specifieke T-cellen.
- Plateer 100 μl/well van de verdunde epitoop-specifieke T-cellen in in totaal 30 tot 60 96-well platen met ronde bodem met behulp van een multichannel pipetteur.
- Incubeer de platen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.
- Voeg op dag 5 100 μl compleet Yssel-medium toe dat 20 u/ml recombinant humaan interleukine-2 (rhIL-2) bevat.
- Identificeer groeiende T-celklonen in de 96-well platen met ronde bodem visueel aan de hand van hun grote pelletgrootte aan de bodem.
- Bereid op dag 11 tot 14 een nieuw feeder-celmengsel voor door bestraalde (4.000 rad) allogene PBMCs bij 1 x 106 cellen/ml, bestraalde (5.000 rad) allogene LCL's bij 1 x 105 cellen/ml en PHA bij 0.1 μg/ml te combineren met behulp van compleet Yssel-medium. Plateer dit nieuwe feeder-celmengsel in een 24-well plaat bij 1 ml/well.
- Aspireer de T-celklonen individueel uit elke well met behulp van een micropipetteur met een volume van ongeveer 200 μl.
- Dispenseer de T-celklonen individueel in de 24-well plaat met het nieuwe feeder-celmengsel. Herhaal dit totdat alle T-celklonen zijn overgeplaatst.
2. Identificeren van epitoopspecifieke T-celklonen met behulp van een ELISPOT-assay voor high-throughput screening (Aangepast van een methode beschreven door Larsson et al.5 )
- Coat 2 steriele ELISPOT-platen (Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA) met 50 μl/well primair anti-IFN-γ monoklonaal antilichaam (kloon D1K, Mabtech, Stockholm, Zweden) verdund tot 5 μg/ml in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) van weefselkweekkwaliteit gedurende minimaal 1 uur bij 4 °C.
- Was de wells met 150 tot 200 μl/well PBS door deze toe te voegen en vervolgens af te gieten. Herhaal dit nog drie keer.
- Blokkeer aspecifieke binding door 50 μl/well gepoold menselijk serum toe te voegen, verdund tot 5% met RPMI 1640, gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C, 5% CO2. Verwijder grote luchtbellen door deze met een steriele naald door te prikken.
- Plateer 1 x 105 autologe LCLs2 in 50 μl RPMI 1640 met 5% menselijk serum per well.
- Meng de cellen in elke well in de 24-wells plaat met T-celclonen met behulp van een 1 ml pipet. Transfer 100 μl per well naar een steriele Eppendorf-buis. Voeg 500 μl RPMI 1640 met 5% gepoold menselijk serum toe aan elke Eppendorf-buis en centrifugeer in een microcentrifuge bij 3.000 RPM gedurende 5 min.
- Giet de Eppendorf-buizen af, voeg 110 μl RPMI 1640 met 5% menselijk serum per buis toe en resuspendeer de cellen met een vortex.
- Plateer telkens 50 μl medium met specifieke T-celclonen, ongeacht het aantal cellen voor snelle screening, in identiek gepositioneerde wells van de 2 platen. Herhaal dit voor alle T-celclonen. Door de stappen voor het tellen van de cellen over te slaan, kan een groot aantal T-celclonen tegelijkertijd worden getest.
- Combineer het resterende medium van verschillende Eppendorf-buizen en plateer telkens 50 μl in de volgende identiek gepositioneerde wells om te dienen als positieve controlewells waaraan PHA zal worden toegevoegd.
- Voeg telkens 50 μl RPMI 1640 met 5% gepoold menselijk serum toe aan elke well die als negatieve controlewell dient en geen T-celclonen bevat.
- Voeg peptiden uit de positieve regio (Tabel 1) toe in 50 μl/well tot een eindconcentratie van 10 μM/peptide. De peptidevoorraden zijn elk opgelost bij 5 mM in 5% - 15% dimethylsulfoxide in PBS, afhankelijk van de oplosbaarheid van het peptide. Elke well bevat een volume van 200 μl (50 μl blokkeringsoplossing, 50 μl LCLs, 50 μl T-celclonen en 50 μl peptiden).
- Voeg 50 μl PHA (eindconcentratie 10 μg/ml) toe aan de positieve controlewells.
- Voeg 50 μl RPMI 1640 met 5% gepoold menselijk serum toe aan de negatieve controlewells.
- Incubeer overnacht bij 37 °C, 5% CO2.
- Was de wells met 150 tot 200 μl/well PBS met 0,05% Tween-20 door deze toe te voegen en vervolgens af te gieten. Herhaal dit nog drie keer.
- Voeg 50 μl PBS toe dat 1 μg/ml van het biotine-geconjugeerde anti-IFN-γ monoklonaal antilichaam (kloon 7B-6, Mabtech) bevat, en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 2 uur. Verwijder grote luchtbellen door deze met een naald door te prikken.
- Bereid twintig minuten voor het einde van de incubatie van 2 uur de avidine-gebonden gebiotineerde mierikwortelperoxidase H (Vectastain Elite ABC kit; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) voor door telkens 2 druppels van oplossing A en oplossing B toe te voegen aan 5 ml PBS met 0,1% Tween-20.
- Was de wells met 150 tot 200 μl/well PBS met 0,1% Tween-20 door deze toe te voegen en vervolgens af te gieten. Herhaal dit nog drie keer.
- Plateer 50 μl/well van de gebiotineerde mierikwortelperoxidase H en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur. Verwijder grote luchtbellen door deze met een naald door te prikken.
- Was de wells met 150 tot 200 μl/well PBS met 0,1% Tween-20 door deze toe te voegen en vervolgens af te gieten. Herhaal dit nog drie keer.
- Plateer 50 μl/well van een kleuringsreagens genaamd stabiele diaminobenzidine (DAB) bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder grote luchtbellen door deze met een naald door te prikken.
- Was de wells met 150 tot 200 μl/well gedeïoniseerd water door deze toe te voegen en vervolgens af te gieten. Herhaal dit nog twee keer.
- Laat de plaat volledig drogen.
- Tel de spots met behulp van een dissectiemicroscoop of een automatische ELISPOT-lezer (AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Duitsland).
3. Bevestigen van de epitoopspecifieke aard van de T-celclonen met behulp van een ELISPOT-assay (Fig. 4)
- Select goed groeiende T-celklonen. Voer een ELISPOT-assay uit zoals hierboven beschreven, behalve dat 1 x 105 autologe LCL's en 1 x 103 T-celklooncellen per well worden geplaatst, samen met elk van de drie peptiden in de regio (Tabel 1) in een concentratie van 10 μM. Zet de assay op in dubblo of triplo.
4. Bepalen of het epitoop endogeen wordt verwerkt (Fig. 5)
- Select goed groeiende T-celklonen. Voer een ELISPOT-assay uit zoals hierboven beschreven, behalve dat er 1 x 105 autologe LCL's geïnfecteerd met recombinant vacciniavirus dat HPV 16 E6, E7 6 tot expressie brengt (vóór de assay) of geen (wild-type, stam WR) (multipliciteit van infectie van 5 gedurende 1 uur) en 1 x 103 T-celklooncellen per well worden geplaatst.
5. Karakterisering van de minimale en optimale sequentie van het T-cel-epitoop (Fig. 6a, 6b en 6c)
- Select goed groeiende T-celklonen. Voer een ELISPOT-assay uit zoals hierboven beschreven, behalve dat 1 x 105 autologe LCL's en 1 x 103 T-celklooncellen per well worden geplaat samen met een van de series overlappende 9-mer peptiden die de regio bestrijken (Tabel 1) bij 10 μM (Fig. 6a).
- Voer een ELISPOT-assay uit zoals hierboven beschreven, behalve dat 1 x 105 autologe LCL's en 1 x 103 T-celklooncellen per well worden geplaat samen met een van de series peptiden van variërende lengte (Tabel 1) bij 10 μM (Fig. 6b).
- Voer een ELISPOT-assay uit zoals hierboven beschreven, behalve dat 1 x 105 autologe LCL's en 1 x 103 T-celklooncellen per well worden geplaat samen met enkele peptiden die waarschijnlijk de minimale en optimale aminozuursequentie bevatten. Deze peptiden worden getest bij concentraties variërend van 10-5 M tot 10-10 M (Fig. 6c).
6. Identificeren van het restrictie-element met behulp van de ELISPOT-assay (Fig. 7)
- Select goed groeiende T-celklonen. Voer een ELISPOT-assay uit zoals hierboven beschreven, behalve dat er 1 x 103 T-celklooncellen per well worden geplaatst, samen met het minimale en optimale peptide bij 10 μM. Tevens worden honderdduizend allogene LCL's per well geplaatst die één of twee HLA-klasse I-moleculen delen met het bestudeerde subject.
7. Bestuderen van de kruisreactiviteit van epitoopspecifieke T-celklonen met homologe aminozuursequenties van andere HPV-typen met een hoog risico (Fig. 8)
- Select goed groeiende T-celklonen. Voer een ELISPOT-assay uit zoals hierboven beschreven, behalve dat 1 x 103 T-celklooncellen per well worden geplaatst samen met peptiden (10 μM) die homologe aminozuursequenties van andere hoog-risico HPV-typen bevatten (Tabel 2). Honderdduizend autologe LCL's per well en allogene LCL's die de beperkende HLA-klasse I-moleculen tot expressie brengen, worden eveneens in de respectievelijke wells geplaatst.
8. Representatieve resultaten
Proefpersoon 1, hier gepresenteerd, was een 22-jarige Afro-Amerikaanse vrouw met een recente voorgeschiedenis van een hooggradige squameuze intraepitheliale laesie, gediagnosticeerd via een biopsie. Zij meldde zich voor een behandeling middels een loop electrical excision procedure op de dag dat de T-cellen werden verzameld1. De ELISPOT-assay van haar CD8 T-cellijn toonde aan dat de HPV 16 E6 46-70 regio (waarbij elke regio wordt getest met 3 overlappende 15-mer peptiden) een T-cel epitoop bevatte (Fig. 2). Het aantal epitoopspecifieke T-cellen, geselecteerd op basis van IFN-γ secretie, bedroeg 1.2 x 105. Na het uitvoeren van een limiting dilution (Fig. 3) op één vijfde van de geselecteerde cellen, werden 262 T-celklonen geoogst. De overige geselecteerde cellen werden niet gebruikt, aangezien de eerste poging tot T-celklonering succesvol was. De high-throughput screening ELISPOT-assay, uitgevoerd op 94 van deze klonen, identificeerde 62 screen-positieve klonen die macroscopisch eenvoudig te identificeren waren in de ELISPOT-plaat. De overige T-celklonen werden niet getest, omdat de eerste ELISPOT-assay reeds peptide-specifieke T-celklonen had geïdentificeerd. Acht goed groeiende screen-positieve klonen werden opnieuw getest met de drie 15-mer peptiden die de regio individueel dekken (Fig. 4). Alle T-celklonen waren positief voor de HPV 16 E6 51-65 peptiden, 6 van de 8 klonen waren positief voor het E6 46-60 peptide, en geen van de klonen was positief voor het E6 56-70 peptide. Testen met autologe LCL's geïnfecteerd met een recombinant vacciniavirus dat HPV 16 E6-eiwit of E7-eiwit tot expressie brengt, toonde aan dat de T-celklonen een endogeen verwerkt E6-epitoop herkennen (Fig. 5). Testen met een reeks overlappende 9-mer peptiden die de HPV 16 46-65 regio dekken (Table 1), toonde de beste respons aan met het E6 53-61 peptide (Fig. 6a). De twee 10-mer peptiden die het E6 53-61 peptide bevatten, twee 8-mer peptiden die in het E6 53-61 peptide bevat zijn, en één 11-mer peptide dat de twee 10-mer peptiden bevat, werden getest; het E6 52-61 (10-mer) peptide bleek het meest consistent de minimale en optimale sequentie te zijn (Fig. 6b). Echter, het E6 53-61 (9-mer) peptide vertoonde een even sterke respons bij T-celkloon #79. Deze T-celkloon werd met deze twee peptiden getest over een breder concentratiebereik, waarbij het E6 52-61 (10-mer) peptide de positiviteit veel effectiever behield dan het E6 53-61 (9-mer) peptide bij lagere peptideconcentraties (Fig. 6c). Het langere E6 52-62 (11-mer) peptide werd niet getest, aangezien het doel was om de kortste sequentie te definiëren die een robuuste respons vertoont. Er werd vastgesteld dat het E6 52-61 (10-mer) peptide de minimale en optimale sequentie bevat.
Het beperkende HLA-klasse I-molecuul van het CD8 T-cel-epitoop kan worden onderzocht met behulp van een ELISPOT-assay waarin allogene LCL's worden gebruikt die één of twee HLA-klasse I-moleculen tot expressie brengen die gemeenschappelijk zijn met de proefpersoon. De resultaten waren echter onbeslist voor Proefpersoon 1 vanwege een hoge achtergrond die werd waargenomen in de ELISPOT-assay. Het HLA-klasse I-beperkende molecuul voor Proefpersoon 1 werd vervolgens geïdentificeerd als B58 met behulp van een chroomvrijgave-assay (gegevens niet getoond). Fig. 7 toont een voorbeeld van een andere proefpersoon [Proefpersoon A, bij wie werd vastgesteld dat de minimale en optimale sequentie van E6 75-83 (KFYSKISEY) werd gedetecteerd zoals beschreven door Wang et al.]7. Er is een hoge positiviteit zichtbaar bij een LCL die de B62- en Cw3-moleculen tot expressie brengt, terwijl achtergrondpositiviteit wordt getoond bij een LCL die Cw3 tot expressie brengt. Een chroomvrijgave-assay bevestigde dat het B62-molecuul het beperkende element was voor Proefpersoon A7.
Sommige regio's van het HPV-genoom zijn goed geconserveerd, en homologe sequenties voor de HPV 16 E6 52-61 regio's waren aanwezig in 13 andere risicovolle HPV-typen (Tabel 2). Sterke kruisreactiviteit (>50% van de spot forming units voor het HPV 16 E6 52-61 peptide) werd aangetoond voor 8 van de 13 risicovolle HPV-typen (Fig. 8).
Figuur 1. Algemeen schema dat de reeks experimenten voor het karakteriseren van nieuwe T-cel epitoop(en) uiteenzet. Dit artikel beschrijft het protocol beginnend vanaf het derde vak van boven.
Figuur 2. Een ELISPOT-assay uitgevoerd om de regio(s) te identificeren die het T-cel-epitoop bevatten. Honderdduizend in vitro gestimuleerde CD8 T-cellen per putje werden uitgeplaat samen met drie overlappende peptides van 15-mers (elk 10 μM) die elke regio binnen de HPV 16 E6- en E7-eiwitten dekken. Dit voorbeeld van Proefpersoon 1 toonde de aanwezigheid van een T-cel-epitoop in de E6 46-70 regio. De staven vertegenwoordigen de standaardfouten van de gemiddelden.
Figuur 3. Een schema dat laat zien hoe epitopen-specifieke T-cellen kunnen worden verdund met behulp van een feeder-celmengsel tot een concentratie van 0,5 cellen per putje.
Figuur 4. Een ELISPOT-assay uitgevoerd om subregio's die het T-cel-epitoop bevatten te identificeren door de drie 15-mer peptiden afzonderlijk te testen. Dit voorbeeld van Subject 1 toonde de aanwezigheid van het epitoop in de subregio's E6 46-60 en E6 51-65. De staven vertegenwoordigen de standaardfouten van de gemiddelden.
Figuur 5. Een ELISPOT-assay die is uitgevoerd om te onderzoeken of het T-cel-epitoop endogeen wordt gepresenteerd. Dit voorbeeld van Proefpersoon 1 toonde aan dat de T-celklonen een endogeen verwerkt E6-epitoop herkenden. De staven vertegenwoordigen de standaardfouten van de gemiddelden.
Figuur 6. ELISPOT-assays uitgevoerd om de kortste en optimale peptidevolgorde van het T-cel-epitoop te karakteriseren. Indien beschikbaar zijn gedurende het gehele proces dezelfde klonen gebruikt. (a) Een ELISPOT-assay uitgevoerd met overlappende 9-mer peptiden. Dit voorbeeld van Proefpersoon 1 onthulde dat het epitoop zich bevindt in de E6 53-61 subregio. (b) Een ELISPOT-assay uitgevoerd om de minimale en optimale peptidevolgorde te identificeren met behulp van peptiden van verschillende lengtes. Dit voorbeeld onthulde dat de kortste en optimale peptidevolgorde het meest consistent het E6 52-61 peptide was, gevolgd door het E6 53-61 peptide. (c) Een ELISPOT-assay uitgevoerd om te bevestigen welk peptide de minimale en optimale volgorde bevat. Het E6 52-61 peptide behield positiviteit bij lagere concentraties en werd bepaald als de kortste en optimale volgorde. De balken vertegenwoordigen de standaardfouten van het gemiddelde.
Figuur 7. Een ELISPOT-assay uitgevoerd om het beperkende HLA-klasse I-molecuul te identificeren. Dit voorbeeld ondersteunde de opvatting dat het B62-molecuul het restrictie-element is voor de CD8 T-celkloon van Subject A die het HPV 16 E6 75-83 epitoop herkent7. Dit werd bevestigd door een chroomvrijgave-assay. De balken vertegenwoordigen de standaardfouten van de gemiddelden.
Figuur 8. Een ELISPOT-assay uitgevoerd om de kruisreactiviteit van HPV 16 52-61 specifieke T-celklonen te beoordelen met vergelijkbare sequenties van andere hoog-risico HPV-typen (Tabel 2). Dit voorbeeld van Proefpersoon 1 toonde significante kruisreactiviteit (>50% positiviteit vergeleken met HPV 16 52-61) in 8 van de 13 andere onderzochte hoog-risico HPV-typen. De balken vertegenwoordigen de standaardfouten van het gemiddelde.
| HPV-type | AA-residuen* | sequentie^ |
| 16 | E6 46-60 (15) | RREVYDFAFRDLCIV |
| 16 | E6 51-65 (15) | DFAFRDLCIVYRDGN |
| 16 | E6 56-70 (15) | DLCIVYRDGNPYAVC |
| 16 | E6 52-62 (11) | FAFRDLCIVYR |
| 16 | E6 52-61 (10) | FAFRDLCIVY |
| 16 | E6 53-62 (10) | AFRDLCIVYR |
| 16 | E6 46-54 (9) | RREVYDFAF |
| 16 | E6 47-55 (9) | REVYDFAFR |
| 16 | E6 48-56 (9) | EVYDFAFRD |
| 16 | E6 49-57 (9) | VYDFAFRDL |
| 16 | E6 50-58 (9) | YDFAFRDLC |
| 16 | E6 51-59 (9) | DFAFRDLCI |
| 16 | E6 52-60 (9) | FAFRDLCIV |
| 16 | E6 53-61 (9) | AFRDLCIVY |
| 16 | E6 54-62 (9) | FRDLCIVYR |
| 16 | E6 55-63 (9) | RDLCIVYRD |
| 16 | E6 56-64 (9) | DLCIVYRDG |
| 16 | E6 57-65 (9) | LCIVYRDGN |
| 16 | E6 53-60 (8) | AFRDLCIV |
| 16 | E6 54-61 (8) | FRDLCIVY |
* Het aantal aminozuren staat tussen haakjes vermeld.
Tabel 1. Aminozuursequenties van HPV 16 E6-peptiden gebruikt om de minimale en optimale antigene peptidesequentie te definiëren.
| HPV-type | AA-residuen* | Sequentie^ |
| 16 | E6 52-61(10) | FAFRDLCIVY |
| 18 | E6 47-56 (10) | FAFKDLFVVY |
| 31 | E6 45-54 (10) | FAFTDLTIVY |
| 33 | E6 45-54 (10) | FAFADLTVVY |
| 35 | E6 45-54 (10) | FACYDLCIVY |
| 39 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 45 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 51 | E6 45-54 (10) | VAFTEIKIVY |
| 52 | E6 45-54 (10) | FLFTDLRIVY |
| 56 | E6 48-57 (10) | FACTELKLVY |
| 58 | E6 45-54 (10) | FVFADLRIVY |
| 59 | E6 47-56 (10) | FAFNDLFIVY |
| 68 | E6 47-56 (10) | FAFGDLNVVY |
| 73 | E6 45-54 (10) | FAFSDLCIVY |
* Het aantal aminozuren wordt tussen haakjes weergegeven.
^ Aminozuurresiduen die verschillen van die in het HPV-16 E6 52-61 epitoop zijn vetgedrukt.
Tabel 2. Aminozuursequenties van peptiden van HPV-typen met een hoog risico die homoloog zijn aan de HPV 16 E6 52-61 CD8 T-cel epitopen, getest om kruisrecognitie te beoordelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Traditioneel probeerden immunologen nieuwe T-cel-epitopen te karakteriseren door de T-cellen van belang in vitro te stimuleren en een limiterend verdunningsexperiment uit te voeren om de epitoopspecifieke T-celklonen te isoleren. Vervolgens werden de T-celklonen gekarakteriseerd met behulp van een chroomvrijmakingsassay 8,9. Veel pogingen waren echter niet succesvol omdat de frequenties van de T-cellen mogelijk te laag waren om te isoleren of omdat er onvoldoende T-celklooncellen beschikbaar waren om ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te melden.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) en NIH-beurzen (R01 CA143130 en UL1RR029884).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CD8 T-cel isolatiekit | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Fytohemagglutinine | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2mg/vial |
| Yssel’s medium | Gemini Bio Products | 400-102 | 1% gepoold menselijk serum |
| 96-wells plaat met ronde bodem | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| Recombinant humaan IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| 24-wells plaat | Corning | 07-200-84 | |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| Primair anti-IFN-γ monoklonaal antilichaam (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| Biotine-geconjugeerd anti-IFN-γ monoklonaal antilichaam (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| Multiscreen HA ELISPOT plaat | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | 100 ml fles |
| Gepoold serum, humaan | Atlanta Biologicals | S40510H | Hitte-geïnactiveerd |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| Stabiel diaminobenzidine | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
Referenties
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
- Walls, E., Crawford, L. Lymphocytes: A practical approach. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable. Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).
- Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).
- Larsson, M. A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals. AIDS. 13, 767-777 (1999).
- Nakagawa, M. Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia. J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).
- Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable. Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).
- Evans, M. Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6. J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).
- Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro. J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).
- Varadarajan, N. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins. Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein. J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).
- Brown, S. A. T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).
- Masemola, A. M. Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa. J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).
- Walker, B. D., Korber, B. T. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity. Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
