Monstervoorbereiding van Mycobacterium tuberculosis Extracten voor Nuclear Magnetic Resonance metabolietvorming

Samenvatting

De metaboloom profiel van Mycobacterium tuberculosis Bepaald na groei in bouillon kweken. Voorwaarden kan worden gevarieerd om het effect van voedingssupplementen, oxidanten en anti-tuberculose middelen te testen op de metabolische profiel van dit micro-organisme. Procedure voor het extract voorbereiding is van toepassing voor zowel 1D ¹ H en 2D ¹ H- ¹³ C NMR analyses.

Samenvatting

Mycobacterium tuberculosis is een belangrijke oorzaak van sterfte in de mens op wereldschaal. De opkomst van zowel multi-(MDR) en uitgebreid-(XDR) resistente stammen dreigt te ontsporen huidige ziekte controle-inspanningen. Er is dus een dringende behoefte aan geneesmiddelen en vaccins die effectiever dan de huidige ontwikkelen. Het genoom van M. tuberculose is gekend voor meer dan 10 jaar, maar toch zijn er belangrijke hiaten in onze kennis van gen-functie en wezenlijkheid. Vele studies hebben sindsdien gebruikt genexpressieanalyse zowel het transcriptoom en proteomische niveaus om de effecten van drugs, oxidatiemiddelen en groeiomstandigheden de algemene patronen van genexpressie te bepalen. Uiteindelijk wordt de uiteindelijke reactie van deze veranderingen weerspiegeld in de metabole samenstelling van de bacterie waaronder enkele duizenden kleine molecuul gewicht. Vergelijken van de metabolische profielen van wildtype en mutante stammen, hetzij onbehandeld of treated met een bepaald geneesmiddel kan efficiënt in doelbepaling en kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe remmers met anti-tbc activiteit. Ook kunnen de effecten van twee of meer voorwaarden metaboloom worden beoordeeld. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een krachtige techniek die wordt gebruikt voor het identificeren en kwantificeren metabole intermediairen. In dit protocol, de procedures voor de opstelling van M. tuberculose celextracten voor NMR metaboloom analyse worden beschreven. Celculturen worden gekweekt onder geschikte omstandigheden en vereist Biosafety Level 3 containment, ¹ geoogst en onderworpen aan mechanische lysis behoud koude temperaturen bewaring van metabolieten maximaliseren. Cellysaten worden teruggewonnen, gefiltreerd gesteriliseerd en opgeslagen bij zeer lage temperaturen. Aliquots van deze celextracten worden uitgeplaat op Middlebrook 7H9 agar voor kolonievormende eenheden geen levensvatbare cellen te verifiëren. Na twee maanden incubatie bij 37 ° C, indien geen vikunnen kolonies worden waargenomen, worden monsters uit de opvangvoorziening voor verdere verwerking. Extracten worden gevriesdroogd, geresuspendeerd in gedeutereerd buffer en geïnjecteerd in de NMR instrument, vastleggen spectroscopische gegevens die vervolgens wordt onderworpen aan statistische analyse. De beschreven procedures kunnen worden toegepast voor zowel eendimensionale ^(1D) 1H NMR en tweedimensionale (2D) ^{1 H-13} C NMR analyses. Deze methode levert meer betrouwbare kleine molecuulgewicht metaboliet identificatie en meer betrouwbare en gevoelige kwantitatieve analyse van celextract metabolische samenstellingen dan chromatografische methoden. Variaties van de beschreven procedure na cellyse stap kan ook worden aangepast voor parallel proteoomanalyse.

Protocol

1. Protocol Tekst

Dit protocol benadrukt de aanpassing van NMR methodologie om M. tuberculose (klasse III agent). Daarom Biosafety Level 3 (BSL3) praktijken moeten worden gevolgd bij de uitvoering van M. tuberculose onderzoek in een jaarlijks gecertificeerd laboratorium. Blootstelling aan laboratorium gegenereerde aerosols is het belangrijkste gevaar waarmee Personen die aan deze micro-organismen. De volgende procedures worden uitgevoerd in onze instelling en variaties kunnen bestaan ​​op basis van de institutionele bioveiligheid Comite aanbevelingen. Gemeenschappelijke persoonlijke beschermingsmiddelen zal bestaan ​​uit een Tyvek pak, bouffant cap, laarsjes, N95 masker, oogbescherming, mouwen, en een dubbel paar nitril handschoenen. Werkzaamheden waarbij M. tuberculose culturen en / of manipulaties met open M. tuberculose containers wordt uitgevoerd in het type A2 of B2 biologische veiligheidskast. Kunststof bedekte absorberend papier op de werken oppervlak. Alle materialen / supplies worden verwijderd of verwijderd uit de inrichting moeten worden geplaatst in twee biohazard zakken en ontsmet door autoclaveren. Werkbladen en apparatuur gebruikt wordt binnen de kast (FastPrep-24 lysis homogenisator, spectrofotometer, emmer met ijs, enz.) moeten worden gedesinfecteerd na iedere werksessie met 1% Amphyl (tuberculocide, bactericide, fungicide en virucide agent). M. tuberculose culturen moeten worden geplaatst onder dubbele containment voor het transport naar grotere apparatuur zich buiten de biologische veiligheid kabinet, zoals diepvriezers, incubatoren, centrifuges en een koelkast. Centrifugeren wordt uitgevoerd met bijgevoegde Veiligheids bekers en O-ring schroefdop buizen. Voor verdere analyse buiten de BSL3 laboratorium worden celvrije extracten gefiltreerd door een 0,2 urn filter of micro warmte gedood bij 95 ° C gedurende 15 minuten. ^Twee monsters worden geplateerd om de afwezigheid van kolonievormende eenheden verifiëren vóór verwijdering van insluiting.

1. Breng 110 ml Middlebrook 7H9 volledige media die polysorbaat 80 (Tween 80 tot klonteren te voorkomen) bouillon (mADC-TW) of een geschikt medium in een 250 ml erlenmeyer. Kweken in drievoud worden routinematig gekweekt per toestand wanneer ^met 13C-metabolieten, tien identieke worden gekweekt voor 1D ^1H NMR profiling. Voor twee voorwaarden (bijvoorbeeld met of zonder toevoeging van geneesmiddel), dubbele kweekvolume per herhaling kunnen worden gekweekt en opgesplitst in twee identieke culturen. Alle reagentia en oplossing recepten worden aan het einde van het protocol.
2. Inoculeer bouillon met 0,150 ml van M. tuberculose 50% glycerol voorraad (laten ontdooien op ijs). Zie hieronder Opmerking 1.
3. Laat de cultuur groeien bij 37 ° C onder schudden bij 100 rpm gedurende 6 dagen _(OD600 0.6-0.8). Zie hieronder Noot 2.
4. Als er geen antibiotica, alternatieve toevoegingen of andere behandelingen nodig zijn, de culturen zijn klaar om te worden geoogst. Als behandelingen worden gebruikt, blijvendirect naar stap 5. Verwijderen van een 0,5 ml monster van de kolf naar een microcentrifugebuis en staan ​​bij 4 ° C voor cultuur titratie en kwaliteitscontrole: verontreiniging tests, fenotypische analyse, PCR tests. Zie hieronder Noot 3. Op dit punt, gaat u verder met stap 6.
5. Verwijder kolven uit shaker en voer de gewenste behandeling (bijvoorbeeld, toe te voegen geneesmiddel of metaboliet). Plaats kolven terug in de shaker en incubeer gedurende een extra periode (bijvoorbeeld, 6-18 uur). Aan het einde van deze tijd, neem een andere 1,0 ml aliquot en bepalen OD _600. Verwijderen van een 0,5 ml monster van de kolf naar een microcentrifugebuis en staan ​​bij 4 ° C voor cultuur titratie en kwaliteitscontrole.
6. Place kweken op ijs gedurende 5 minuten. Na deze stap laat cellen op ijs door het gehele resterende protocol. Harvest kweken door centrifugeren bij 2000 xg en 4 ° C gedurende 15 min in 50 ml buisjes met een benchtop centrifuge. Elke cultuur vereist vier buizen met 25 ml elk (totaal 100 ml moet voldoende signaal-ruis verkrijgen 2D ^1H-13C NMR experimenten, waar slechts 50 ml per cultuur vereist 1D ¹ H NMR experimenten).
7. Was elke cel pellet twee keer met ijskoude ddH ₂ O (ongeveer 15 ml de eerste keer 10 ml tweede) door centrifugering parameters hierboven beschreven. Voor de tweede wassing, combineren 10 ml in dezelfde buis voor het spinnen. Resuspendeer de celpellet in een eindvolume van 1,0 ml ddH ₂ O (moeten aanpassen voor celpellet volume). Als een enkele celsuspensie zonder klonteren gewenst is bij deze stap kunnen cellen kort gesoniceerd en / of door een 27-gauge naald driemaal. Als alternatief kan de cel pellet worden ingevroren bij -80 ° C en bewaard tot verdere verwerking. In het laatste geval worden ingevroren pellets ontdooid op ijs voor resuspensie. Resuspendeer de celkorrels in een eindvolume van 1,0 ml ddH ₂ O zoals hierboven vermeld.
8. Transfer de 1,0 ml celsuspensie aan een 2,0 ml buis met schroefdop Lysing Matrix B (0,1 mm silicabolletjes). Plaats de FastPrep-24 lysis homogenisator in de bioveiligheid kast. Plaats de monsters in de monsterhouder, waarmee de retentie spaak plaat bovenop de buis. Verwerk de monsters gedurende 60 sec in de homogenisator bij een snelheid van 6 meter / sec.
9. Draai de monsters in een microcentrifuge bij 15.000 xg en 4 ° C gedurende 10 min om celafval en pellet intacte cellen.
10. Verwijder supernatant en passeren monster door een spuitfilter (0,2 urn) in een steriele buis. Plaat 0,1 ml monster (of een representatief deel van het monster, bijvoorbeeld 10%) op mADC agar te verifiëren dat er geen levensvatbare cellen. Onderzoekers kunnen voeren ook meer dan een filtratie stap en / of te controleren op de aanwezigheid van levensvatbare cellen in de extracten met behulp van live-dead staining procedures worden vastgesteld om te voorkomen of om eventuele bioveiligheid zorgen. Freeze monsters in een ethanol-droogijsbad op te slaanbij -80 ° C totdat ze gereed zijn gevriesdroogd en verwerkt in een NMR inrichting.
11. Na 2 maanden controleren platen afwezigheid van kolonievormende eenheden verifiëren. Als er geen CFU's zijn gevonden, kunnen monsters worden genomen uit de BSL3 laboratorium. Verdere analyse wordt uitgevoerd in een standaard NMR inrichting, die normaliter dient meerdere gebruikers en werkt in geen specifieke inperkingsmaatregelen.
12. Lyofiliseren de monsters tot droog, dan resuspendeer in 0,7 ml buffer NMR overgebracht in een microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende 3 min bij 13.000 x g. Verwijder 0,6 ml en transfer naar een 5 mm NMR-buis. Als alternatief zou gevriesdroogde monsters worden gemaild naar een externe voorziening als niet-biologisch reguliere monsters.
13. NMR gegevens onmiddellijk verzameld. Ondanks alle voorzorgsmaatregelen kunnen actieve enzymen nog aanwezig en het monster is typisch niet stabiel gedurende lange tijd. Veranderingen in de NMR spectrum merkbaar wanneer de monsters weggelaten bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende meer dan 1 week. Ook is NMR het verzamelen van gegevens afgewisseld tussen onbehandelde en drugs behandelde culturen, waar monsters willekeurig gekozen worden uit elke categorie. Dit voorkomt onnodige vooroordelen omdat een bepaalde categorie had een langere vertraging voor de NMR-spectra werden verzameld. Een bias in de data zou gebeuren als de NMR spectra voor alle onbehandelde monsters werden eerst verzameld en gevolgd door het geneesmiddel behandelde monsters. Indien de monsters niet onmiddellijk worden geanalyseerd door NMR moet monsters worden in 1 ml Eppendorf buisjes bij -80 ° C.
14. Nadat de monsters in een BACS-120 monsterwisselaar, kalibratie, die enkele routine stappen zoals lock, shim, aanpassen en optimaliseren van de 90 ° puls lengte omvat, moet de kwaliteit van de resultaten te maximaliseren. Een monster wordt gebruikt om de 90 ° pulslengte kalibreren en het instrument voor de overige samples afstemmen. Vergrendelen, shimming, en NMR het verzamelen van gegevens voor elk monster is geautomatiseerd using ICONNMR en gradshim.
15. Een 1D ^1H NMR-spectrum wordt verzameld met de Bruker zgesgp pulsreeks met wateronderdrukking met excitatie beeldhouwen. Een totaal van 32k datapunten met een sweep breedte van 5482.5Hz, 128 scans, en 16 dummy scans worden gebruikt. Een 2D ^1H-13C HSQC spectrum wordt verzameld met de Bruker hsqcetgp pulssequentie. Een totaal van 2048 datapunten met een sweep breedte van 5000,0 Hz wordt verzameld langs de direct ¹ H-maat, en 64 data punten met een sweep breedte van 18864,9 Hz langs de indirecte ¹³ C dimensie. Het spectrum wordt verzameld met 128 scans en 16 dummy scans goed signaal te krijgen voor lawaai.

Figuur 1. Een stroomdiagram van de experimentele procedures afgebeeld.

NMR-buffer

Voorraadoplossing van 50 mM kaliumfosfaat buffer met 50 uM TMSP:

• 2,17 g K ₂ HPO ₄ (kalium dibasisch)
• 1,70 g KH ₂ PO ₄ (kalium monobasisch)
• 7,86 mg natrium-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D ₄ (D, 98%))
• Los in 500 ml van "100%" D ₂ O
• De uiteindelijke oplossing moet op een pH 7,2 (ongecorrigeerde)

MADC-TW of MOADC-TW (1 L)

• 4,7 g Middlebrook 7H9 bouillon basis
• 900 ml ddH ₂ O
• 2 ml glycerol
• Meng de bestanddelen en autoclaaf gedurende 25 min. Koele vloeistof aan te raken en voeg de volgende oplossingen:
• 100 ml ADC bij het opstellen van mADC of 100 ml OADC bij het opstellen van MOADC
• 2,5 ml 20% Tween 80 (eventueel 1 ml van niet-metaboliseerbare 20% Tyloxapol)
• 10 ml 1% cycloheximide

ADC (1 L)

• 20 g D (+)-Glucose
• 50 g BSA FractionV
• 8,5 g NaCl
• 800 ml ddH ₂ O
• Los samen, zet het volume op 1 L en steriliseren met 0,2 um filter. Bewaar bij 4 ° C.

Alternatief, OADC (1L) te bereiden, voeg alle componenten zoals hierboven plus 50 ml van 1% oliezuur (recept hieronder maakt een 250 ml batch). Los samen, zet het volume op 1 L en steriliseren met 0,2 um filter. Fles moet worden verpakt in aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C.

• 2,5 g Oliezuur
• 250 ml 0,2 M NaOH
• Thaw oliezuur (vast wordt bij koeling) door verwarming bij 55 ° C gedurende 10 min en voeg NaOH oplossing en verwarm onder roeren gedurende 60 minuten. Bewaren in steriele glazen flessen die zijn verpakt in aluminiumfolie. Seal flessen met parafilm en bewaar bij 4 ° C.

Indien gewenst, kunt u de aanschaf commerciële BD BBL Middlebrook ADC of OADC met catalase Verrijking.

1% Cycloheximide (100ml)

• 1 g cycloheximide
• 100 ml ddH ₂ O

Los op en steriliseren met 0,2 urn filter. Bewaar bij 4 ° C. Let op: cycloheximide is giftig dus hanteer met uiterste zorg.

20% (v / v) Tween 80 (100ml)

• 20 ml Tween 80
• 80 ml _​​2 O ddH

Alternatief wegen 20 g Tween 80 (ongeveer 18,9 ml; dichtheid 1,06 g / ml), 20% w / v oplossing te bereiden. Heat oplossing tot 55 ° C gedurende 30 min op te lossen en meng volledig. Steriliseren vloeistof met een 0,2 urn filter. Bewaar de uiteindelijke oplossing bij kamertemperatuur.

20% (v / v) Tyloxapol (100ml)

• 20 ml Tyloxapol
• 80 ml _​​2 O ddH

Alternatief wegen 20 g Tyloxapol (ongeveer 18,2 ml; dichtheid 1,1 g / ml), 20% w / v oplossing te bereiden. Heat oplossing tot 55 ° C gedurende 30 minuten tot dissolve, en meng volledig. Steriliseren vloeistof met een 0,2 urn filter. Bewaar de uiteindelijke oplossing bij kamertemperatuur.

Opmerking 1: glycerol voorraden van M. tuberculose worden bereid met het volgende protocol.

Stocking van M. tuberculose

• Grow M. tuberculose in 50 ml verzadigd mADC (OD ₆₀₀ = 1,5 tot 2,0) bij 37 ° C onder schudden omstandigheden (100 rpm). Afhankelijk van de stam, zal dit 7-14 dagen.
• Spin monsters 2.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min te korrelkweek. Verwijder supernatant.
• Resuspendeer in 6 ml steriel 50% glycerol.
• Aliquot 1,5 ml in 4 Corning cryogene vials en label op de juiste wijze.
• Onmiddellijk flash freeze flesjes in ethanol / droog ijsbad en bewaar bij -80 ° C.

Opmerking 2: inenten stam H37Rv (-80 ° C voorraad tot 1,5 jaar) in 70 ml mADC media levert een OD _{600 <}/ Sub> of ongeveer 0,6 na 5 dagen groei bij 37 ° C onder schudden omstandigheden (100 rpm) in een Innova 40 Shaker.

Opmerking 3: cultuur besmetting te testen, onderzoekers zou een cultuur hoeveelheid enten op standaard rijk medium en controleer afwezigheid van groei na incubatie gedurende de nacht. Routinematig worden cultures uitgeplaat op agar met mADC koloniemorfologie observeren en door fase-contrast microscopie onderzocht. Desgewenst cultures worden geverifieerd door PCR primers gebruikt, wordt 6110 beschreven. ^Drie

2. Representatieve resultaten

Een monster dat goed voorbereid levert een NMR spectrum lijkt op de in figuur 2. Dit spectrum is een weergave van de M. tuberculose wild-type metabole zwembad. De geïdentificeerde metabolieten zijn direct of indirect verband houden met de D-alanine pad. Ook de grootte van piekintensiteit is evenredig met metaboliet aanwezige concentratiesin het celextract. Daarom veranderingen in de intensiteit van de piek tussen onbehandelde culturen, medicamenteuze behandeling, en mutante stammen kunnen aangeven verstoringen in metabolieten en metabole routes. De M. tuberculosis 1D ^1H NMR spectra werden op een Bruker Avance 500 MHz spectrometer uitgerust met een triple-resonantie, Z-as gradient cryosonde. Het spectrum bevat ca. 400 pieken, waaruit kon identificeren en kwantificeren 40-50 metabolieten, waaronder aminozuren, nucleotide voorlopers en glycolytische tussenproducten en citroenzuur. A-120 BACS monsterwisselaar met Bruker Icon software werd gebruikt om de NMR gegevensverzameling automatiseren. 1D ^1H NMR spectra werden verzameld excitatie sculpting ⁴ efficiënt te verwijderen van het oplosmiddel en onderhouden van een vlakke basislijn, waardoor elke noodzaak voor baseline collectie artefacten kunnen veroorzaken in volgende principal component analysis (PCA) of orthogonale partial least squares discriminant analyse (OPLS- DA). A 1D ¹ H NMR-spectrum wordt verzameld bij 25 ° C met een spectrum breedte van 5482,5 Hz en 32K gegevenspunten. Een totaal van 16 dummy scans en 128 scans werden gebruikt om het spectrum te verkrijgen. De ACD Labs 1D NMR processor software werd gebruikt om semi-automatisch verwerken alle 1D ^1H NMR spectra. De spectra waren Fourier getransformeerd, gefaseerde, en gerelateerd aan het TMSP piek (0,0 ppm). De NMRpipe softwarepakket gebruikt om individueel verwerken 2D ^1H-13C NMR spectra en geanalyseerd met NMRDraw. De Bruker FID databestand werd voor het eerst geconverteerd naar een bestandsformaat herkenbaar aan NMRpipe en daarna het spectrum werd Fourier getransformeerd, fase gecorrigeerd, en nul gevuld. De waargenomen NMR-pieken in de 1D ^1H NMR spectrum en 2D ^1H-13C NMR spectrum worden toegekend aan specifieke metabolieten met ^1H en ^13C chemische verschuiving toleranties van 0,05 en 0,50 ppm, respectievelijk, en de Madison Metabolomics Consortium Database (MMCD ) ^{5 de BioMagResBank, 6 en de Human metaboloom Database. 7 Met name de 1D en 2D NMR-spectra zijn handmatig piek-picked, waarbij de piek lijst van NMR chemische verschuivingen vervolgens geüpload naar de Human metaboloom Database. De metabolieten die de Human metaboloom Database toegewezen aan de NMR spectrum gebaseerd op zowel maximaliseren van het aantal passende NMR resonanties die behoort tot een metabole netwerk. Elke verbinding of metaboliet heeft meestal meerdere CH paren en dienovereenkomstig meerdere NMR resonanties. Dus, hoe meer van deze NMR resonanties die worden waargenomen in de experimentele NMR spectrum, hoe waarschijnlijker de metaboliet aanwezig is. Ook identificeren meerdere metabolieten associëren met dezelfde route verhoogt de kans juiste opdrachten. De aanwezigheid van metabolieten en metabole routes worden geverifieerd met de Kyoto-Encyclopedie van genen en genomen (KEGG) 8 en de MetaCyc databases. 9 Mycobacterium smegmATIS is een bruikbaar model voor M. tuberculose en andere mycobacteriële ziekteverwekkers. Zoals elders beschreven monsters van M. smegmatis kan ook worden verstoord door sonicatie 10.}

Figuur 2. 1D ^1H NMR spectrum van Mycobacterium tuberculosis celextract. NMR-pieken in verband met de representatieve metabolieten zijn gelabeld. Afkortingen zijn: AMP, adenosine mono fosfaat, α-Kg, α-ketoglutaraat, Glu, glutamaat en Ala, alanine.

Discussie

Een groot aantal studies hebben de transcriptoom-en proteoomanalyse profielen van M. tuberculose onder verschillende in vitro en in vivo omstandigheden. ^11-16 uiteindelijk veranderingen in genexpressie en enzymactiviteit leiden tot variaties in de concentraties van kleine moleculen molecuulgewicht. De volledige beschrijving van deze verbindingen vormt het metaboloom. Aldus kunnen de effecten van drugs en ​​wisselende groeiomstandigheden op metabolisme gevolgd door metabolische analy...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens / Equipment	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
ADC Verrijking	BD BBL Middlebrook	212352
BACS-120 Sample Changer	Bruker
Bruker Avance NMR	Bruker		500 MHz
Bovine Serum Albumine	Fisher Scientific	BP1600-100	Fractie V
Centrifugeer	Beckman Coulter	Allegra X-15R	Benchtop
Centrifuge Tubes	Corning	430291	50 ml steriele polypropyleen
Cryogene Vials	Corning	430488	2,0 ml steriele polypropyleen
Cycloheximide	AG Wetenschappelijke	C-1189	Giftig
D (+) - Glucose	ACROS	41095-0010
Deuteriumoxide	Sigma Aldrich	617385
Erlenmeyer Flask	VWR	89095-266	Steriel, vlakke bodem, polycarbonaat, 0,22 pm PTFE membraan ontluchtingsdop
Flash Freeze Flask	VWR	82018-226	750 ml
Freeze Dryer	VWR	82019-038	4,5 L Benchtop
Glycerol	GibcoBRL	15514-029
Broedmachine	New Brunswick	Innova 40	Benchtop shaker
Lyseren Matrix B	MP Biomedicals	6911-100
Lysis Machine	MP Biomedicals	FastPrep-24
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D	Benchtop
Microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 22R	Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth	Difco	271310
NMR-buizen	Norell	ST500-7	5 mM
OADC Verrijking	BD BBL Middlebrook	212351
Oliezuur	Sigma	O1008
Kalium Dibasisch	VWR	BDH0266
Kalium monobasisch	VWR	BDH0268
Rotor - microfuge 22R	Beckman Coulter	F241.5P	Afgedichte en polypropyleen
Rotor - Allegra X-15R	Beckman Coulter	SX4750	Met biologische covers
Natriumchloride	Fisher Scientific	S271-3
Natrium-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4	Cambridge Isotope	DLM-48
Spectrofotometer	Beckman Coulter	DU-530
Spectrofotometer Cuvetten	Reddingslijn	LS-2410	1,5 ml polystyreen, 2 duidelijke kanten
Injectiespuit	Becton Dickinson	309585	Steriele 3 ml Luer-Lok
Spuitfilter	Nalgene	190-2520	0,2 urn steriel celluloseacetaat
Tween 80	Fisher Scientific	BP338-500