De methode beschrijft de procedure waarmee de Hawaiiaanse bobtail inktvis, Euprymna scolopes En bacteriële symbiont, Vibrio fischeri, Afzonderlijk en vervolgens verhoogd ingevoerd voor het specifieke kolonisatie van de inktvis licht orgel door de bacteriën. Kolonisatie detectie door bacterieel afgeleide luminescentie en door directe kolonie tellen worden beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kolonisatie van Euprymna scolopes Squid door Vibrio fischeri
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Specifieke bacteriën worden gevonden in samenwerking met dierlijk weefsel 1-5. Deze host-bacteriële verenigingen (symbiose) kunnen schadelijk zijn (pathogene), hebben geen fitness gevolg (commensale), of nuttig zijn (mutualistische). Hoewel veel aandacht is besteed aan pathogene interactie, is er weinig bekend over de processen die de reproduceerbare overname van nuttige / commensale bacteriën uit de omgeving bepalen. Het licht-orgel mutualisme tussen het mariene Gram-negatieve bacterie V. fischeri en de Hawaiiaanse bobtail squid, E. scolopes, staat voor een zeer specifieke interactie waarbij een host (E. scolopes) een symbiotische relatie met slechts een bacteriesoort (V. fischeri) in de loop van de levensduur van 6,7. Bioluminescentie door V. fischeri tijdens deze interactie geeft een anti-agressieve voordeel E. scolopes tijdens nachtelijke activiteit 8,9, terwijlde voedselrijke gastheerweefsel biedt V. fischeri met een beschermde nis 10. Tijdens elke host generatie, wordt deze relatie samengevat, zodat aan een voorspelbaar proces dat kan in detail worden beoordeeld in verschillende stadia van symbiotische ontwikkeling. In het laboratorium, de jeugdige inktvis luik aposymbiotically (uncolonized), en, indien verzameld binnen de eerste 30-60 minuten en overgebracht naar symbiont-vrij water, kan niet worden gekoloniseerd, behalve door de experimentele inoculum 6. Deze interactie geeft een nuttig modelsysteem waarin de afzonderlijke stappen die leiden tot de specifieke verkrijging van een microbe symbiotische uit de omgeving 11,12 beoordelen.
Hier beschrijven een werkwijze om de mate van kolonisatie die optreedt wanneer pasgeboren aposymbiotic E. beoordelen scolopes worden blootgesteld aan (kunstmatige) zeewater met V. fischeri. Deze eenvoudige test beschrijft inenting, een natuurlijke infectie, en herstelvan de bacteriële symbiont van de ontluikende lichtorgel van E. scolopes. Er wordt op een consistente omgeving voor de dieren tijdens het symbiotische ontwikkeling, in het bijzonder met betrekking tot de kwaliteit van het water en licht signalen. Methoden om de beschreven symbiotische bevolking kenmerken omvatten (1) meting van bacterieel afgeleid bioluminescentie, en (2) directe kolonie tellen van teruggewonnen symbionten.
Protocol
1. Voorbereiding van Bacteriële Inocula
- Dag 0
Twee dagen voorafgaand aan de inktvis inoculatie, het bord van de relevante bacteriestammen op LBS 13 agar. - Incubeer bacteriën bij 25-28 ° C geroerd.
- Dag 1
Inoculeer 3 ml LBS medium in een glazen cultuur buis met een kolonie van elk V. fischeri stam voor infectie. Bereid dubbele buizen als back-up. - Dag 2
(Coördineren van bacteriële stappen 1.4-1.6 met inktvis stappen 3.7-3.10)
1 h vóór de inoculatie, subcultuur bacteriën 1:80 (37,5 pi) in 3 ml LBS in een glazen buis e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De beschreven kolonisatie assay maakt analyse van een natuurlijk proces symbiotische in een gecontroleerde laboratorium. Als zodanig kan worden gebruikt om kolonisatie beoordelen door mutante stammen door verschillende natuurlijke isolaten en onder verschillende chemische regimes. Variaties op de beschreven experimenten worden vaak gebruikt om verschillende aspecten van de symbiose te beoordelen. De kinetiek van de kolonisatie kan worden gemeten door behandeling luminescentie tijdens de eerste 24 uur, die automatisch ku.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Mattias Gyllborg voor inktvis facilitaire ondersteuning en voor reacties op dit manuscript, Michael Hadfield en de Kewalo Marine Laboratory voor hulp tijdens de veld verzamelen, en leden van de Ruby en McFall-Ngai Laboratorium voor bijdragen aan dit protocol. Werk in de Mandel Laboratorium wordt ondersteund door NSF IOS-0843633.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
| Glas Cultuur Buizen, 16 mm diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps voor het Glazen Cultuur Tubes | Visser | NC9807998 | |
| Zichtbaar spectrofotometer voor de bepaling van OD 600 | Biowave | CO8000 | Een spectrofotometer geschikt voor het meten OD 600 zal werken. Dit apparaat kan de OD-600 direct te meten van de vloeistof in het glas cultuur buizen. Enige aanpassing van het inoculum berekening noodzakelijk zijn afhankelijk van de gebruikte instrument. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Vergelijkbaar met de Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Inclusief de microcentrifugebuis houder. |
| GloMax 20/20 licht Standard | Promega | E5341 | Voor kalibratie luminometer. |
| Refractometer, Handheld | Foster en Smith Aquatics | CD-14035 | Kalibreer voor elk gebruik met gedemineraliseerd water. Spoel na elk gebruik met gedemineraliseerd water om zout Voorkom het opbouwen. |
| Instant Ocean (kunstmatig zeewater concentraat) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Bereid op 35 ‰ in gedeïoniseerd water, met behulp van de refractometer, gevolgd door filtreren door een 0,2 um SFCA filter. |
| Filtratie-eenheid | Nalgene | 158-0020 | Vrij van oppervlakteactieve celluloseacetaat (SFCA) membraan 0,2 pm. Wij hebben waargenomen verschillende resultaten enkele oppervlakte-bevattende PES filters. |
| Transfer Pipetten | Visser | 13-711 -9 uur | Met behulp van schaar of scheermesje, snij de punt netjes boven de eerste graat naar de diameter van de pipetpunt te verhogen en te voorkomen knijpen de inktvis jongen. |
| Wegwerp Sample Bowls (plastic bekers) | Komeet | T9S (9 oz.) | Kommen voor de enting, met boven een diameter van 3 ¼ ", lagere diameter van 2 ¼", hoogte 3 ". Schalen creëren van een homogene omgeving omdat ze geen onderrand, waar inktvis vast komt te zitten in een zuurstofarme niche. De grootte is geoptimaliseerd voor 40-ml inoculum. Verkrijgbaar bij webstaurantstore.com, # 619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter overeenkomt met de opening aan de luminometer PMT. |
| 1,5 ml PCR | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Buizen moeten passen bij de vorm van de stampers. |
| Ethanol, 200 Proof | Visser | BP2818-100 | |
| Stampers | Kimble Chase / Kontes | 749521-1500 | |
| Plating kralen, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Bereid 5 per buis en autoclaaf. |
Referenties
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
