Methodenartikel

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

DOI:

10.3791/3778

⸱

9 april 2012

 ,  , 
1Department of Medicine, Section of Cardiology, St. John-Providence Health System, 2Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sommige muizenstammen in staat zijn om de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) te weerstaan ​​met myeline basisch eiwit. Hier beschreven is een eenvoudige immunisatieprotocol dat het niet-reageren omkeert en induceert verlammende ziekte in een aantal typische EAE resistent muis vlekken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE) is een ontstekingsziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) en is gebruikt als diermodel voor studie van de menselijke demyeliniserende aandoening, multiple sclerose (MS). EAE wordt gekenmerkt door pathologische infiltratie van mononucleaire cellen in het centraal zenuwstelsel en klinische manifestatie van paralytic ziekte. Net als bij MS, EAE is ook onder genetische controle in dat sommige muizenstammen zijn vatbaar voor de ziekte van inductie, terwijl anderen zijn tegen. Gewoonlijk C57BL / 6 (H-2b) muizen geïmmuniseerd met myeline basisch eiwit (MBP) niet geraakte tekenen ontwikkelen. Dit is zeker niet ongevoeligheid te wijten zijn aan antigeen of antigeen verwerking presentatie van MBP, als een experimentele protocol beschreven werd gebruikt om ernstige EAE induceren C57BL / 6 muizen en andere bekende resistente muizenstammen. Bovendien was encefalitogene T celklonen uit C57BL / 6 en Balb / c muizen reactief MBP is succesvolledig geïsoleerd en gepropageerd.

De experimentele protocol gaat met behulp van een mobiele adoptieve overdracht systeem waarin MBP-primer (200 ug / muis) C57BL / 6 donor lymfeklier cellen worden geïsoleerd en gekweekt gedurende vijf dagen met het antigeen aan het zwembad van MBP-specifieke T-cellen uit te breiden. Aan het einde van de kweekperiode worden 50000000 levensvatbare cellen overgebracht naar naïeve syngene afnemers de staartader. Ontvanger muizen dus normaal gesproken behandeld ontwikkelen geen EAE, dus opnieuw hun resistente status, en zij kunnen voor onbepaalde tijd normaal. Tien dagen na de cell transfer, zijn ontvangende muizen uitgedaagd met volledig Freund's adjuvans (CFA)-geëmulgeerde MBP in vier plaatsen in de flanken. Ernstige EAE begint in deze muizen de ontwikkeling van tien tot veertien dagen na challenge. De resultaten toonden aan dat de inductie van de ziekte was antigene specifiek uitdaging met irrelevante antigenen veroorzaakte geen klinische symptomen van de ziekte. Opmerkelijk is dat een titratie van het antigeen dosis gebruikt om detegen de ontvanger muizen toonde aan dat het kan vanaf 5 ^ g / muis. Bovendien is een kinetische studie van het tijdstip van een antigeen is gebleken dat uitdaging ziekte induceren effectief was al 5 dagen na een antigeen en zolang dan 445 dagen na antigeen. Deze gegevens sterk punt in de richting van de betrokkenheid van een "lange duur" T-cel populatie in het handhaven van niet-reageren. De betrokkenheid van regulatoire T-cellen (Tregs) in dit systeem is niet gedefinieerd.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiden CFA-geëmulgeerde Antigen

  1. Los cavia MBP (bereid volgens de werkwijze van Swanborg1 en opgeslagen in gevriesdroogde vorm bij 4 ° C) in fosfaatbufferoplossing (PBS) in een concentratie van 2 mg / ml. Als gesynthetiseerd MBP peptiden (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 worden gebruikt, stelt een 2 mg / ml oplossing. Opstellen van een geschikte hoeveelheid antigeen-oplossing (0,1 ml per muis om te worden gevaccineerd) in een glazen injectiespuit met luer-lok.
  2. Stel een volume volledig Freund's adjuvans H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) gelijk aan het antigeen oplossing in een injectiespuit met luer-lok.
  3. Sluit de twee glazen spuiten met een drie-weg kraan. Meng de MBP oplossing met de CFA door op de plunjers heen en weer. Houd de beweging tot een emulsie wordt gevormd.
  4. Om te testen of er een emulsie ontstaat, duwt al het mengsel in een spuit. Maak de lege spuit, trek thij zuiger iets en ontladen een druppel van de resterende emulsie in een bekerglas van schoon water bij kamertemperatuur. Indien de emulsie druppel blijft intact op het oppervlak van het water wordt een emulsie gevormd. Als de emulsie druppel verspreidt, sluit u de spuiten en verder het mengen beweging.
  5. Gebruik een 1 ml plastic spuit voor de immunisatie proces om de levering van een nauwkeurige dosering van antigeen te verzekeren. Om het antigeen emulsie te dragen aan de plastic spuit, trek de zuiger en plaats de lege plastic spuit in de opening van drie-weg kraantje waar de vorige glazen injectiespuit werd verbroken als in 1.4.
  6. Vul de plastic spuit van de rand door de zuiger van de injectiespuit. Plaats de zuiger van de plastic spuit heen en terug te duwen overtollige emulsie tot het bereiken van de 1,2 ml markering op de plastic spuit. Deze manoeuvre zorgt ervoor dat er geen luchtbel zit gevangen in de plastic spuit.
  7. Verwijder het plastic spuit van de drie-weg kraan. Attach een # 26 gauge naald voor aan de plastic spuit. Duw de zuiger naar de 1 ml markering, zodat de emulsie nu het dode volume van de naald vult.

2. Immunisatie van Donor Muizen

Let op: Vrouw C57BL / 6 muizen zijn meestal geïnjecteerd met antigeen-emulsie in vier plaatsen in de flanken, naar aanleiding van de methoden die oorspronkelijk ontworpen door de groep McFarlin's 3 bij de National Institutes of Health. Voor een ervaren onderzoeker, kan een persoon uit te voeren van de gehele taak. Voor beginners, kan hulp worden gevraagd, zodat een persoon de muis houdt en de andere persoon doet de injectie. Alternatief kan de muis worden verdoofd voor de injectie.

  1. Vasthouden van de muis bij de nek en de huid leggen dat de staart tussen de 4 e en 5 e vingers zodanig dat de thorax en de buik zijn gemakkelijk bereikbaar.
  2. Plaats de naald van de 1 ml plastic spuit op een plaats in de thorax iets boven de rechter oksel (van de mogebruiken) en subcutaan injecteren 0,05 ml van het antigeen emulsie. Een kleine uitstulping van de witachtige CFA kan worden gezien door de bleke huid. Herhaal hetzelfde voor de site in de thorax iets boven de linker oksel.
  3. Laat de staart en pak de rechtervoet (van de muis), draai hem en houd hem tussen de 4 e en 5 e vingers. Ga naar de website net onder de rib geval in de rechter flank en injecteer 0,05 ml van het antigeen emulsie.
  4. Laat de rechter voet, draait u de muis de andere kant op en houd de linker voet (van de muis) tussen de 4 e en 5 e vingers. Ga naar de website net onder de rib geval in de linkerflank en injecteer 0,05 ml van het antigeen emulsie.
  5. Ga verder met een nieuwe naald na de injectie van 10 muizen, of als de naald wordt afgestompt.

3. Isolatie van lymfeknoopcellen voor Tissue Culture 7 tot 10 dagen na immunisatie

  1. Zeven tot 10 dagen na immunisatie, offeren de muizenen verwijder de drainerende lymfeklieren. De voorkeursmethode van euthanasie met CO2 inhalatie. Na het offer, leg de muis op zijn rug op een dissectie bord met de ledematen gestrekt en bevestigd aan het bord met pinnen. De muizen werden bevochtigd met een nevel van 70% ethanol.
  2. Ingesneden in de huid lengterichting in het midden van de onderzijde van de buik naar de kin met steriele scharen en tang.
  3. Snij de buik huid van het gebied van de lies aan elke poot. Trek en speld van de huid, waardoor de lies lymfeklieren.
  4. Snijd de huid langs de voorpoten (links en rechts), zodat de huid kan worden geschild terug en vastgepind op de axillaire lymfeklieren in de buurt van de oksels bloot te leggen.
  5. Met twee paar tang samen te werken, weg te trekken het bindweefsel over en rond de lies lymfeklieren. Als het bindweefsel worden gewist, zet een paar tangen onder de lymfeklier en weg te trekken uit het lichaam. Plaats hetlymfeklieren in een 35 mm petrischaal gevuld met steriele PBS.
  6. Trek de bindweefsels die de twee okselklieren gebruik van twee paar pincetten. Isoleer de lymfeklieren en plaats ze in de petrischaal. Wees zeer voorzichtig dat u de bloedvaten het oversteken van de gebied als bloeding maakt het identificeren van de lymfeklieren heel moeilijk te doorbreken.
  7. Nadat alle lymfeklieren worden verzameld, verplaatst u de petrischaal op een bioveiligheid kap. Breken en uit elkaar te plagen de lymfeklieren met de twee paren van de verlostang, slijpen de een tegen de ander. Alternatief kan de lymfeknopen worden gebroken met de platte kant van de plunjer van een 3 ml plastic spuit drukken tegen de lymfeknopen op de bodem van de petrischaal.
  8. Haal het gepest lymfeklier celsuspensie door middel van een nylon mesh aan de membranen en vuil te verwijderen.
  9. Maak de lymfeklier celsuspensie tot 50 ml met een steriele PBS. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 10 minuten. Resuspendeer de pellet in kweekmedium. Doe een levensvatbare cell tellen en de concentratie aan te passen aan 4 x 10 6 cellen / ml. UseRPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfserum, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat MEM, 0,1 mM MEM niet essentiële aminozuren, 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 10 mM Hepes buffer en 5 x 10 -5 M 2-ME. Pre-warm de cultuur voordat resuspenderen de cellen.
  10. Cultuur de cellen in 24-well kweekplaten met 2 ml per putje (eindcelconcentratie 8 x 10 6 cellen / putje). Voeg antigeen in elk putje met een uiteindelijke concentratie van 100 pg / ml. Plaats de cultuur plaat in een 37 ° C incubator met 5% CO 2. Incubeer cellen gedurende 5 dagen.

4. Oogsten Gekweekte lymfeknoopcellen 5 dagen na aanvang van culturen

  1. Meng de cellen in elk putje met en neer te pipetteren een Pasteur pipet of glas een klein volume pipet. Oogst de cellen een 50 ml centrifugebuis.
  2. Centrifugeer de cellen bij 1000 rpm gedurende 10 minuten. Resuspend de celpellet in een klein volume PBS.
  3. Tel cellen en stel de levensvatbare cellen concentratie 2,5 x 10 8 cellen / ml met steriele PBS. Teken de cellen in een injectiespuit voorzien van een # 26 gauge naald.
  4. Plaats een warmte lamp boven de kooi van de ontvangende muizen om te helpen verwijden de staartader.
  5. Een muis houder uitstrekken de staart van de muis door de gleuf in de houder. Trek aan de staart uit te breiden. Zoek de ader.
  6. Injecteer 0,2 ml / muis van de celsuspensie gelijk 5 x 10 7 cellen.

5. Antigene uitdaging van de ontvanger Muizen 20 dagen na de Cell overdracht en ontwikkeling van de ziekte symptomen

  1. Challenge ontvanger muizen niet tekenen van de ziekte met het antigeen. De procedures zijn dezelfde als hoofdstuk 2 inzake "Immunisatie van Donor Muizen".
  2. Let op de ontwikkeling van de ziekte van verlamde 7 tot 10 dagen na de antigene uitdaging.
    1. Ziekte begint met zwakte in de staart. Ziekte wordt ingedeeld bij eenAls de staart wordt slap. Ziekte wordt ingedeeld bij een 2 als de muis is verlamd in een achterpoot. Ziekte wordt beoordeeld 3 wanneer beide achterpoten verlamd zijn en de muis sleept beide achterste ledematen bij het kruipen naar voren. Ziekte wordt beoordeeld 4 wanneer de muis verliest gebruik van beide voorpoten, waardoor de muis volledig immobiel. Ziekte wordt beoordeeld 5 wanneer de muis is ten dode opgeschreven en het lichaam krult omhoog. De dood wordt gescoord als de ziekte van klas 6 4.
  3. MBP-specifieke EAE geïnduceerd in C57BL / 6 muizen na dit protocol is monofasische. De muizen kunnen herstellen van de ziekte, maar niet ondergaan spontane terugval.

6. Representatieve resultaten

Muizen die ontvangen primer en in vitro-uitgebreide donor lymfeknoopcellen niet ontwikkelen van EAE symptomen van de ziekte, als gevolg van hun resistentie tegen ziekten inductie. Echter, ernstige ziekte ontwikkeld na antigene uitdaging (Tabel I), waaruit blijkt het vermogen van de antigene uitdaginghet omkeren van de resistentiemechanisme. Twee speciale kenmerken van de bekende antigene uitdaging is de dosering van antigeen en de kinetiek van uitdaging om ziekte te veroorzaken. Zeer lage dosis antigeen nodig als weergegeven in tabel III. Verrassenderwijs kan muizen die donorcellen een jaarlijks nog vroeger van ernstige ziekte bij provocatie met het antigeen (Tabel IV). Deze twee observaties suggereren de betrokkenheid van de "lange duur" T-cellen in het handhaven van EAE weerstand. Dit protocol is voor vele EAE resistente muizenstammen 4.

figure-protocol-1
Figuur 1. Stroomdiagram van de experimentele opzet voor de inductie van EAE in het beroemde resistente muizenstammen.

Klinische EAE
Na adoptieve overdracht 		Klinische EAE
na antigene uitdaging
Spannen Antigeen incidentie Av. ziekte van kwaliteit
(Bereik) 		Av. dag van het begin
(Bereik) 		Incidentie Av. ziekte van kwaliteit
(Bereik) 		Av. dag van het begin
(Bereik)
SJL MBP 21/21 4.0 (3-5) 8.0 (6-10) ND ND ND
C57BL / 6 MBP 0/10 - - 7/7 3.85 (3-5) 9.28 (9-10)
Balb / c MBP 0/7 - - 5/5 3.2 (3-4) 7.0 (7)
C3H/HeJ MBP 0/7 - - 4/4 3.2 (3-4) 8.0 (8)
C57BL / 6 MBP 60-80 0/4 - - 4/4 2.75 (2-4) 10.2 (9-11)

Tabel I. Inductie van MBP-gemedieerde EAE in C57BL / 6 muizen. Adoptieve overdracht van primer en in vitro-uitgebreide donor cellen induceerde geen EAE in C57Bl / 6 muizen. Antigene uitdaging bericht cel overdracht maakte de muizen gevoelig voor de ziekte van inductie. Av., Gemiddeld. ND, niet gedaan.

Klinische EAE na antigene uitdaging
Priming Antigen Challenge antigeen Incidentie Av. ziekte van kwaliteit
(Bereik)		 Av. dag van het begin
(Bereik)
MBP-CFA CFA alleen 0/3 - -
MBP-CFA OVA-CFA 0/3 - -
MBP-CFA MBP-CFA 3/3 4.0 (4.0) 7.7 (7-9)

Tabel II. De specificiteit van de antigene uitdaging. Ontvanger muizen geprikkeld met de priming antigeen en andere irrelevant antigenen. Alleen de priming antigeen veroorzaakt ernstige ziekte. OVA: kip ovalbumine. Av., Gemiddeld.

Klinische EAE na antigene uitdaging
Challenge antigeen doses (ug / muis) Incidentie Av. ziekte van kwaliteit
(Bereik) 		Av. dag van het begin
(Bereik)
200 4/4 3.75 (3-4) 8.25 (7-9)
100 4/4 3.67 (3-4) 7.5 (7-8)
50 4/4 3.25 (3-4) 8.25 (7-10)
25 4/4 3.0 (3.0) 8.25 (8-9)
10 4/4 3.0 (3.0) 8.76 (8-9)
5 4/4 2.5 (2-3) 9.75 (9-10)
1 2/4 1.0 (1.0) 16 (14-18)
0 0/4 - -

Tabel III. Challenge antigeen doses die nodig zijn voor de ziekte van inductie. Verschillende concentraties van MBP gebruikt voor het ontvangende muizen uitdagen werden getest. Av., Gemiddeld.

Klinische EAE na antigene uitdaging
Challenge antigeen Dag van de Uitdaging Incidentie Av. Ziekte kwaliteit
(Bereik) 		Av. Dag van het begin
(Bereik)
MBP-CFA 5 3/4 1.33 (1-2) 9.67 (9-10)
MBP-CFA 10 4/4 3.0 (3.0) 8.25 (7-9)
MBP-CFA 15 4/4 3.75 (3-4) 7.25 (7-8)
MBP-CFA 25 4/4 4.0 (4.0) 8.0 (7-9)
MBP-CFA 35 4/4 3.5 (3-4) 7.5 (7-8)
MBP-CFA 60 4/4 3.75 (3-4) 9.0 (8-10)
--------------------------
MBP-CFA 343 3/3 3.0 (3.0) 10.33 (10-11)
MBP-CFA 445 3/3 3.0 (3.0) 7.0 (7.0)

Tabel IV. Kinetiek van antigene uitdaging. Ontvanger muizen werden uitgedaagd op verschillende tijdstip bericht vast te stellenive cel overdracht. Av., Gemiddeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studies van EAE in muizen vaak gebruik maken van de neuroantigens, myeline basis eiwit (MBP), proteolipid proteïne (PLP) of myeline oligodendrocyt eiwit (MOG). Eerdere studies meestal gebruikt MBP. PLP stimuleert sterke en consistente reacties van SJL muizen. Meer recent, MOG is de gebruikte gemeenschappelijke neuroantigen omdat B6 muizen zijn gevoelig voor de ziekte van inductie met dit antigeen. Veel van het gen gerichte muizenstammen op de B6 genetische achtergrond. Interessant, B6 muizen zijn gevoelig voor inductie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen financiële informatie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mede ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 NS37253 en N01 NS055167) en de National Multiple Sclerosis Society (RG 3288-A6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Cavia ruggenmerg Rockland Immuno-chemicaliën, Inc
Gilbertsville, PA 19525
www.rockland-inc.com 		GP-T065 bevroren
Freund's adjuvans, compleet H37Ra Difco Laboratories
Detroit, MI 		231131
Multifit uitwisselbaar kunnen spuit BD
www.bd.com / ons 		512133
RPMI 1640 MediatechInc
Manassas, VA
www.cellgro.com 		10 tot 040-CM
OVA Sigma-Aldrich
www.sigmaaldrich.com 		A5503
Muizen Jackson Laboratory
Bar Harbor, Maine 		B6 muizen: 0000664

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swanborg, R. H. Experimental allergic encephalomyelitis. Methods in Enzymology. Sabato, G. D. 162, Academic Press. New York, NY. 413-421 (1988).
  2. Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage. J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).
  3. McCarron, R., McFarlin, D. E. Adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J, PL/J, and (SJL/J x PL/J)F1 mice. Influence of I-A haplotypes on encephalitogenic epitope of myelin basic protein. J. Immunol. 141, 1143-1149 (1988).
  4. Shaw, M. K., Kim, C., Ho, K. -L., Lisak, R. P., Tse, H. Y. A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains. J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).
  5. Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. S., Wekerle, H. Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis. Nat. Med. 15, 626-632 (2009).
  6. Anderson, A. C., Reddy, J., Nazareno, R., Sobel, R. A., Nicholson, L. B., Kuchroo, V. K. IL-10 plays an important role in the homeostatic regulation of the autoreactive reperteroire in naïve mice. J. Immunol. 173, 828-834 (2004).
  7. Anderton, S. M. Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed. Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).
  8. Arnon, R. Experimental allergic encephalomyelitis - susceptibility and suppression. Immunol. Rev. 55, 5(1981).
  9. Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., Carton, H. Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-g. J. Immunol. 140, 1506-1510 (1988).
  10. Arbomson-Leeman, S., Alexander, J., Bronson, R., Corroll, J., Southwood, S., Dorf, M. Experimental autoimmune encephalomyelitis-resistant mice have highly encephalitogenic myelin basic protein (MBP)-specific T cell clones that recognize a MBP peptide with high affinity for MHC class II. J. Immunol. 154, 388-398 (1995).
  11. Reddy, J., Illes, Z., Zhang, X., Encinas, J., Nicholson, L., Sobel, R. A., Wucherpfennig, K. W., Kuchroo, V. K. Myelin proteolipid protein-specific CD4+CD25+ regulatory cells mediate genetic resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15434-15439 (2004).
  12. Korn, T., Reddy, J., Gao, W., Bettelli, E., Awasthi, A., Petersen, T. R., Backstrom, B. T. Myelin- specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature Med. 13, 423-431 (2007).
  13. Shaw, M. K., Li, J., Ho, P. P., Hao, H., Lisak, R. P., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific adoptive experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Longevity of donor T cells and lack of disease relapses. Neuroimmunology Research Focus. Broglie, P. V. , Nova Science Publisher. New York. 175-191 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Myeline basisprote neisolatie van lymfeklierencelkweekintraveneuze injectiecompleet adjuvant van Freundinductie van ziekte

Gerelateerde artikelen