Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

Summary

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Abstract

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.

Introduction

Glycosylation van eiwitten, dat is de meest voorkomende post-translationele modificatie van eiwitten, wijzigt de fysische, chemische en biologische eigenschappen van een eiwit, en speelt een fundamentele rol in verschillende biologische processen^1-6. Omdat het glycosylatieapparaat bijzonder vatbaar is voor ziekteprogressie en maligne transformatie, is aberrante glycosylering herkend als vroege detectiemarkers voor kanker en andere ziekten ^7-12. In feite zijn de meeste huidige kankermarkers, zoals de L3-fractie van α-1 foetoproteïne (AFP) voor hepatocellulair carcinoom ^13-15, en CA199 voor pancreaskanker ^{16, 17} allemaal aberrante glycan-moieties op glycoproteïnen. Echter, methoden om eiwitglycosylering te bestuderen zijn ingewikkeld en niet geschikt voor routinematige laboratorium- en klinische omgevingen. Chen et al. heeft onlangs een chemisch geblokkeerd antilichaam geïntroduceerd microarray met een glycan-bindend eiwit (GBP) detectiemethode voor hoogdoorvoer en multiplexed profile glycosylering van native glycoproteïnen in een complex monster ¹⁸. In deze affiniteit gebaseerde microarray-methode, meerdere geïmmobiliseerde glycoproteïne-specifieke antilichamen vangen en isoleren glycoproteïnen uit het complexe mengsel direct op de microarray-slide, en de glycanen op elk individueel gevangen eiwit worden gemeten door GBP's. Omdat alle normale antilichamen N-glycanen bevatten die door de meeste GBP's kunnen worden herkend, is de cruciale stap van deze methode om de glycanen op de antilichamen chemisch te blokkeren om aan GBP te binden. In de procedure werden de cis-diolgroepen van de glycanen op de antilichamen eerst geoxideerd tot aldehydegroepen door gebruik van NaIO₄ in natriumacetaatbuffer, licht vermijdend. De aldehydegroepen werden vervolgens geconjugeerd aan de hydrazidegroep van een cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoFenylbutenzuurhydrazide HCl (MPBH), gevolgd door de conjugatie van een dipeptide, Cys-Gly, aan de maleïmidegroep van de MPBH. Dus werden de cis-diolgroepen op glycanen van antilichamen omgezet in omvangrijke niet-hydroxylgroepen, die het binden van lectines en andere GBP's aan de gevangen antilichamen belemmerden. Deze blokkeringsprocedure zorgt ervoor dat de GBP's en lectines alleen aan de glycanen van gevangen eiwitten binden. Na deze chemische blokkering werden serummonsters geïncubeerd met de antilichaammicroarray, gevolgd door de detectie van glycanen met behulp van verschillende gebiotineerde lectines en GBP's, en gevisualiseerd met Cy3-streptavidine. Het parallel gebruik van een antilichaampaneel en meerdere lectineproefbuizen biedt discrete glycosyleringsprofielen van meerdere eiwitten in een bepaald monster ^18-20. Deze methode is met succes gebruikt in meerdere verschillende laboratoria ^{1, 7, 13, 19-31}. Echter, stabiliteit van MPBH en Cys-Gly, ingewikkelde en uitgebreide procedure in deze methode beïnvloeden de reproduceerbaarheid, effectiviteit en efficiëntie van de methode. In dit nieuwe protocol vervangen we zowel MPBH als Cys-Gly door een veel stabieler reagens glutamaathydrazide (Glu-hydrazide), wat de reproduceerbaarheid van de methode aanzienlijk verbeterde, vereenvoudigde en de hele procedure verkorte, zodat deze binnen één werkdag kan worden voltooid. In dit nieuwe protocol beschrijven we de gedetailleerde procedure van het protocol dat gemakkelijk kan worden toegepast door normale laboratoria voor routinematige eiwitglycosyleringstudie en technieken die nodig zijn om reproduceerbare en herhaalbare resultaten te verkrijgen.

Protocol

1. Druk een antilichaam Microarray voor de test

1. Verdun alle antilichamen tot 0,5 mg / ml in fosfaatbuffer zoutoplossing, pH 7,2 (PBS).
2. Aliquot 40 pi van elk antilichaam in het 384-wells bron plaat.
3. Plaats de 384-wells source plaat op de Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
4. Laad 20 PATH microarray dia's op de microarrayer als doel.
5. Stel de microarrayer tot 48 identieke subarrays, waarin 27 antilichamen en controle eiwitten worden gespot in drievoud in een 9x9 patroon (figuur 1E, 1F) af te drukken.
6. Start de microarrayer aan het antilichaam microarray dia's af te drukken.
7. Verzamel het antilichaam microarray dia's, en bewaar ze in dia's cassette met droogmiddel. Vacuümafsluiting de cassette in een plastic zak met behulp van vacuumsealer (Foodsaver).
8. Bewaar de gesloten microarray dia's bij 4 ° C in de koelkast.

2. Chemisch Blokkeer de Antilichaam Microarray tot GBP voorkomenBinding aan de Capture Antilichamen

De microarray test begint zodra de microarray dia's zijn chemisch geblokkeerd en duurt ongeveer 8 uur. Eenmaal begonnen de microarray test moet worden uitgevoerd (stap 2 tot 8).

1. Neem de microarray schuift uit de koelkast, en evenwicht ze op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
2. Verwijder de schuif van de doos en kort te spoelen in fosfaatbuffer zoutoplossing pH 7,2 met 0,1% Tween 20 (PBST0.1) eenmaal een dia wastafel, en in 15 mM natriumacetaat buffer pH 5,0 met 0,1% Tween (CBT0 0,1) in een sequentiële wijze. Incubeer de glaasjes in CBT0.1 gedurende 10 minuten in een diaweergave wastafel.
3. Bereid verse 150 mM NAIO ₄ in 15 mM natriumacetaat buffer pH 5,0 (CB), en bewaar het in in een dia wastafel in de koelkast terwijl het vermijden van licht voor gebruik.
4. Verwijder de dia in de CB, en zet hem in het bassin met vers NAIO ₄ met het antilichaam kantnaar boven. Bedek de bekken met aluminiumfolie licht voorkomen en de schuif bekken incuberen gedurende 2 uur onder zacht schudden bij 4 ° C in de koelkast.
5. Bereid 300 ml 10 mM hydrazide glutaminezuur (de blokker) in CB.
6. Verwijder de dia in de bekken, en kort te spoelen in CB 3 keer gedurende 5 minuten per keer in slide wastafel.
7. Incubeer de glaasjes in de blokkering in een wastafel 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
8. Verwijder de dia's van het bekken, en was ze met PBST0.1 gedurende 3 minuten.

3. Blokkeren Niet-specifieke banden van de Microarray met Bovine Serum Albumine (BSA)

1. Bereid 300 ml 1% BSA in fosfaatbuffer zoutoplossing pH 7,2 met 0,5% Tween (PBST0.5) in een dia wastafel, en incuberen de microarray schuif in het bassin 1 uur bij kamertemperatuur zacht schudden.
2. Spoel de dia's in PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
3. Zet de schuifop een dia rek, en spin op 1.200 xg op een centrifugatie gedurende 2 minuten op de microarray slide drogen.

4. Impressum Wax Grid op de Microarray Schuif aan elke subarray Scheid

1. Voorverwarmen was imprinter bij 70 ° C gedurende 5 minuten.
2. Laad de geblokkeerde microarray dia in de was imprinter met antilichaam zijde aan de was. Trek de hendel te prenten was in de dia gelijkmatig.

5. Breng serummonsters op de Microarray Slide

1. Tijdens Stap 2.4, voor te bereiden serummonsters voor een van beide glyco profilering test in een monster (5.1.1), of enkele glyco epiptope meting met meerdere samples (5.1.2).
   1. In een experiment voor de glycaan profileringen van meerdere serum glycoproteïnen in een serum monster door het gebruik van meerdere euro's (zie voorbeeld experiment 1), zal een serummonsters worden toegepast op alle subarrays. In dit geval wordt 40 pi serum voldoende verdund in 360 pi PBS die 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml muis IgG, 100 pg / ml rat IgG, 100 pg / ml konijn IgG, 100 pg / ml geit IgG en 100 pg / ml ezel IgG. Deze hoeveelheid is voldoende voor toepassing 6 pi serum verdunde oplossing op elke deelgroepering.
   2. In een experiment voor de een glycan meting op meerdere serum-eiwitten met meerdere serummonsters met behulp van een GBP detecties (zie voorbeeld experiment 2). In dit geval wordt een pi serum voldoende verdund in 9 pi PBS die 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml muis IgG, 100 pg / ml rat IgG, 100 pg / ml konijn IgG , 100 pg / ml geit IgG en 100 pg / ml ezel IgG. Deze hoeveelheid is voldoende voor toepassing 6 ul verdund serum oplossing op elke deelgroepering.
2. Na wax opdruk in stap 4, zorgvuldig toe te passen 6 pl van de verwaterde monster of controlemonsters (PBST0.1) aan elke subarray van de dia. Incubeer de dia in een vochtige cassette met natte papieren handdoeken bij kamertemperatuurgedurende 1 uur.
3. Spoel de dia met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
4. Droog de dia door spinnen bij 1200 g gedurende 2 minuten.

6. Breng Gebiotinyleerde GBP (Lectin of Anti-glycaan antilichaam) op de Slide

1. Tijdens Stap 2,4, voor te bereiden 10μg/ml van gebiotinyleerde lectinen / Gbps in PBST0.1.
   1. In glycaan profilering experiment dat sonde een monster met meerdere lectines (sample experiment 1), voor te bereiden 350 ul van gebiotinyleerd lectine dat is voldoende voor alle subarrays.
   2. In een glycan epitoop / biomarker screening in meerdere monsters met verschillende lectines bereiden 10 pi van elke gebiotinyleerde lectine dat voldoende is voor een deelgroepering.
2. Breng 6 pi van het verdunde gebiotinyleerde lectine (s) elk subarray van de slede en incuberen in de bevochtigde preparaatdozen natte papieren handdoekjes bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
3. Spoel de dia's met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten elke time.
4. Droog de foto door het draaien van het op 1200 xg in centrifuge voor 2 minuten.

7. Breng Dye Labeled NeutrAvidin voor fluorescentie detectie

1. Bereid 350 pl van Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin dat is voldoende voor alle subarrays.
2. Breng 6 pl van Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin op elk subarray, en incubeer de dia in de bevochtigde slide cassette bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
3. Spoel de dia met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
4. Droog de glijbaan door het draaien van het op 1200 xg in centrifuge voor 2 minuten.

8. Zorg voor Microarray Slide Image by Het scannen van de Slide

1. Scan de foto met behulp van een fluorescentie microarray scanner op 10 micrometer resolutie. De laser PMT instellingen zijn zo sterk mogelijk, maar geen verzadiging spot wordt waargenomen.

9. Data-extractie en analyse

1. Open de afbeelding in ArrayPro 3.2.
2. Stel de array template op basis van de array kaart die het antilichaam plekken locaties laat zien. Lijn elke sjabloon cirkel op de bijbehorende plek in de afbeelding.
3. Pak de intensiteit van elke plek in een Excel-bestand voor verdere analyse.

10. Representatieve resultaten

Voorbeeld Experiment 1

Glycosylering profilering van meerdere serum glycoproteïnen in hepatocellulair carcinoom patiënten serum monster volgens chemisch geblokkeerd antilichaam microarray met meerdere lectinen detectie.

Het doel van dit experiment is om de individuele glycosylatieprofiel van 20 glycoproteïnen ontdekken in hepatocellulair carcinoom (HCC) patiënt serummonster met behulp van chemisch geblokkeerd antilichaam microarray met lectine-detectie. Een antilichaam microarray, dat 48 identieke subarrays waarvan 26 antilichamen en biotine-BSA onder meer bevat, is ontworpen en vervaardigd, zoals beschreven in Stap 1. Deze 26 antilichamen waren tegen 20 serum glycoproteïnen dat geïdentificeerd als veelbelovend vroege diagnose waarde HCC patiënten met lectine basis immunoprecipitatie gecombineerd met massaspectrometrie proteïne-identificatie ^{12, 32} zoals weergegeven in tabel 1. Het patroon en opstelling van het antilichaam spots gedrukt in drievoud in een representatief subarray worden getoond in figuur 1E en 1F respectievelijk. Twee identieke microarray dia's, een niet chemisch geblokkeerd (figuur 1A), terwijl de andere was (figuur 1B) werden gebruikt voor het uitvoeren van hetzelfde experiment glycosylering profilering om het belang van de chemisch te blokkeren procedure tonen de analyse. Voor het chemisch geblokkeerd dia (figuur 1B), het experiment begon op de Stap 2, want het geen chemisch geblokkeerd slide (Figuur 1A), het experiment gestart vanaf Stap 3. Het experiment werd uitgevoerd door following alle stappen beschreven in het protocol, behalve voor stap 5.1.2 en 6.1.2. In de stap 5,2, werd een PBST0.1 controlemonster aangebracht op subarrays in kolom 1 en 3, en samengevoegd HCC serummonster werd aangebracht op subarrays in kolom 2 en 4, respectievelijk (zie figuur 1G). Deze vergelijking is de doeltreffendheid, efficiëntie van de procedure, als de antigeen-bindende affiniteit van de antilichamen vertonen na chemisch te blokkeren. 22 gebiotinyleerd lectines (zie tabel 1) die specifiek zijn voor verschillende glycanen ^{18, 20} toegepast op elke deelgroepering zoals afgebeeld in figuur 1G voor glycosylering profilering. Beelden van de chemisch geblokkeerd (Figuur 1B) en niet-chemisch geblokkeerd (Figuur 1A) microarrays na de glycosylering profilering test door het volgen van het protocol. Zoals in de deelgroeperingen in kolom 1 en 3 niet-chemisch geblokkeerd microarrays (figuur 1A en figuur 1C), waarinAlleen PBST0.1 toegepast meeste lectines gebonden antilichamen vangen en bleek zeer hoge achtergrond die vergelijkbaar zijn met die van vlakjes in kolom 2 en 4, waarop het serum monster werd aangebracht. Het is onmogelijk om glycosyleringsprofiel informatie te verkrijgen uit deze microarray dia. Integendeel, bij hetzelfde experiment werd uitgevoerd op een chemisch geblokkeerde antilichaam microarray dia de vlakjes in kolom 1 en 3, waarin alleen PBST0.1 werd toegepast meeste lectines heeft weinig of geen binding aan antilichamen te vangen, terwijl hoge antigen bindings nog waargenomen subarrays in kolom 2 en 4, waarop serum monster werd aangebracht (figuur 1B en 1D). Deze resultaten toonde de chemisch te blokkeren procedure was een cruciale stap voorgrond het meten van de glycanen op de antilichaam-gevangen glycoproteïnen. Door het volgen van het protocol, kan glycosylering profielen van 22 glycoproteïnen in HCC serum worden verkregen.

Experiment 2

Scherm voor gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers om gediscrimineerd levercirrose en hepatocellulair carcinoom patiënten.

Het doel van dit experiment is om te screenen op gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers die levercirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC) patiënten discrimineren. Anders dan de Experiment 1, waarbij slechts een serummonster werd aangebracht op elk van vlakjes en gemerkt met verschillende lectines, in deze assay totaal 40 verschillende serummonsters van HCC cirrosepatiënten toegepast op elke deelgroepering en gehybridiseerd met een lectine (AAL ). Statistische analyse, zoals T-test, ontvanger-operating characteristic (ROC) curve, is gedaan om de uitkeringen of diagnostische prestaties van de glycan epiptope / biomarker op elke individuele eiwitten in alle serummonsters te evalueren. We gebruiken het antilichaam microarray vervaardigd Experiment 1, behalve anti-CA19-9 en anti-Lewis X antilichamen in deze studie. De expertiserimentele vond plaats van 2 tot 09 september stap, behalve voor de Step 5.1.1 en 6.1.1. Totaal 40 serum monsters van 20 levercirrose en 20 HCC patiënten bij willekeurig subarray van vlakjes 48 met de controle PBS monsters als negatieve controle. Fucosylation van elk van de gevangen eiwitten werd gedetecteerd met gebiotinyleerd Fucose specifieke lectine. De microarray beeld van figuur 1 blijkt het lectine AAL slechts gebonden serumeiwitten gevangen op de microarray (Figuur 2D) in plaats van gevangen antilichamen (figuur 2E). De AAL-binding intensiteiten van alle plaatsen werden vervolgens geëxtraheerd en geanalyseerd met behulp van T-test en ROC curves om de prestaties van de fucosylation (AAL binding intensiteit) van elk serum eiwit op de discriminatie tussen de HCC en cirrose groepen te evalueren. De resultaten toonden aan dat de fucosylation van GP73 eiwit de beste discriminatie tussen de twee groepen gegeven met een p = 0,03 en het gebied ondercurve van de ROC curve is gelijk aan 0,72. Dit experiment toonde deze procedure is een snelle, efficiënte methode voor het glycan epitoop / biomarker screening op meerdere monsters in meerdere eiwitten.

ID	Naam van het serum	Afkorting	Vennootschap	Catalog #
L1	Gebiotinyleerde Concanavaline A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Gebiotinyleerd Sambucus nigra Lectin	SNA	Vector Laboratories	B-1305
L3	Gebiotinyleerd Lens Culinaris agglutinine	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Gebiotinyleerd Ricinus Communis agglutinine I	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Gebiotinyleerd Aleuria aurantia Lectin	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Gebiotinyleerd Erythrina Cristagalli Lectin	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Gebiotinyleerd Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Gebiotinyleerd Wheat Germ agglutinine	WGA	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Gebiotinyleerd Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Gebiotinyleerd Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Biotinylated Peanut agglutinine	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Gebiotinyleerd Pisum sativum agglutinine	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Gebiotinyleerd Dolichos Biflorus agglutinine	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Gebiotinyleerd Datura stramonium Lectin	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Gebiotinyleerd Sophora Japonica agglutinine	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Gebiotinyleerd Soja agglutinine	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Gebiotinyleerd Solanum tuberosum (aardappel) Lectin	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Gebiotinyleerd Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin I	GSL I	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Gebiotinyleerd Vicia villosa Lectin	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Gebiotinyleerd Lycopersicon esculentum (tomaat) Lectin	LEL	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Gebiotinyleerd Ulex europaeus agglutinine I	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Gebiotinyleerd Jacalin	JACALIN	Vector Laboratories	BK-3000
A1	Geit F (ab ') 2 Fragment anti-humaan IgM, Fc5μ antilichaam	IgM	Jackson Immuno Onderzoek	109-006-129
A2	Donkey F (ab ') 2Frag anti-humaan IgG (H + L) antilichaam	AB1	Jackson Immuno Onderzoek	709-006-149
A3	Muis anti-humaan IgG F (ab ') 2 monoklonaal antilichaam	AB3	Jackson Immuno Onderzoek	209-005-097
A4	Geit anti-humaan alpha 2 macroglobuline polyklonaal antilichaam	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Konijn anti-humaan alfa-1-antitrypsine polyklonaal antilichaam	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Muis anti-humaan alfa-1-antitrypsine monoklonaal antilichaam	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Konijn anti-humaan alfa-1-antitrypsine polyklonaal antilichaam	ACT	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	Konijn anti-humaan alfa-1-antichymotrypsin polyklonaal antilichaam	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Muis anti-humaan transferrine monoklonaal antilichaam	Transferrine	GeneTex	GTX101035
A10	Konijn anti-humaan transferrine polyklonaal antilichaam	Transferrine	GeneTex	GTX77130
A11	Geit anti-humaan apolipoproteïne J polyklonaal antilichaam	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Muis anti-humaan GP73 monoklonaal antilichaam	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Muis anti-humaan GP73 monoklonaal antilichaam	GP73	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGIE INC	sc-101275
A14	Konijn anti-humaan alpha-1 foetoproteïne polyklonaal antilichaam	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	Muis anti-humaan alpha-1-fetoproteïne monoklonaal antilichaam	AFP	Fitzgerald	10 A05A
A16	Muis anti-humaan hemopexin monoklonaal antilichaam	Hemopexin	Assaypro	60,190 tot 05.011
A17	Muis anti-humaan glypican-3 (1G12) monoklonaal antilichaam	GPLv3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Muis anti-humaan kininogen (LMW) monoklonaal antilichaam	Kininogen	Assaypro	20333 tot 05011
A19	Konijn anti-humaan MMP-21 monoklonaal antilichaam	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Muis anti-humaan CEACAM-een monoklonaal antilichaam	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
Een21	Rat anti-humaan DPPIV/CD26 monoklonaal antilichaam	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Muis anti-humaan PIVKA II monoklonaal antilichaam	PIVICA	Crystal chem	8040
A23	Muis anti-carcino-embryonaal antigeen	CEA	Amerikaanse biologische	C1300
A24	Muis anti-CA125 Cancer Antigen	CA125	Amerikaanse biologische	C0050-01D
A25	Muis anti-CA19-9 kanker antigeen	CA19-9	Amerikaanse biologische	C0075-18
A26	Muis anti-Lewis x monoklonaal antilichaam	Lewis X	Calbiochem	434631
bio	Gebiotinyleerd BSA (positieve controle)	Bio	Huisgemaakte	N / A

Tabel 1. Lijst van lectinen en antistoffen die in dit protocol.

Naam van / het reagens s apparatuur	Vennootschap	Catalogusnummer
Niet contact microarrayer	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplaat	Visser	14-230-243
Foodsaver	Foodsaver	V3835
Ultradunne nitrocellulose coate microarray schuift	Gentel	PATH
Slide Imprinter (optioneel)	De Gel Company	WSP60-1
Shaker	Visser	15-453-211
Centrifugeer	Eppendorf	5804 000.013
Schuif wastafel / Slide Staining Dish wie Verwijderbare Rack	Visser	08-812
Slide incubatiekamer / microscoopglaasje box	Visser	03-448-5
Brij 35, 30 w / v% oplossing in water	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Visser	P337-100
Natriumperjodaat (NAIO 4)	Sigma	311448
L-Glutaminezuur γ-hydrazide	Sigma	G-7257
Natriumacetaat watervrij (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Bovine Serum Albumine (BSA)	Lampire Biologische Labs	7500804
Fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) (10X)	Denville Wetenschappelijk	CP4390-48
Dylight 549 geconjugeerd NeutrAvidin	Thermo	22837
Proteaseremmer Cocktail Tabletten	Roche	4693159001
ChromPure humaan IgG, Fc-fragment	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure humaan IgG, volledige molecuul	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure muis IgG, volledige molecuul	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure muis IgG, Fc fragment	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure konijn IgG, volledige molecuul	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, hele molecuul	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray scanner	Tecan	LS Reloaded

Tabel 2. Lijstvan apparatuur en reagentia die in dit protocol.

Schema 1 Een schema met de lectine antilichaam microarray gebaseerd glycan ontdekking van biomarkers proces 1 (stap 2 tot 4): Blokkeer het antilichaam microarray met de blokker (Glu-hydrazide) en BSA, 2 (stap 5):.. Van toepassing serummonsters en vast te leggen specifieke glycoproteïnen met specifieke antilichamen, 3 (stap 6): van toepassing gebiotinyleerd lectine (s), 4 (stap 7): Probe de gebiotinyleerde AAL met Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin voor microarray imaging.

Figuur 1. Microarray-beelden van de Sample Experiment 1 glycosylering profilering van meerdere serum glycoproteïnen in HCC patiënt serum monster volgens chemiebondgenoot geblokkeerd antilichaam microarray met meerdere lectine detectie. Twee identieke microarray dia (A) geen chemisch geblokkeerd of (B) chemisch geblokkeerd zoals beschreven in Stap 2, beide ging alle stappen 2-9 voor glycosylering profilering, en vergelijkingsdoeleinden. (A) en (B) worden de microarray afbeeldingen die gescand zijn Stap 8 in een resolutie van 10 micron. (C) het inzoomen beeld van de eerste twee rijen van het geen chemisch geblokkeerd microarray glijbaan (A); (D) het inzoomen beeld van de eerste twee rijen van de niet chemisch geblokkeerd microarray slide (B)), (E) het schema van het antilichaam regeling binnen elke subarray; (F)-array kaarten: de locatie van elk antilichaam binnen de subarray, elk antilichaam naam staat voor 3 spots; (G) Serum monster en lectine locatie: een diagram laat zien welke subarray elk serum monster en lectine werd aangebracht op.

Figuur 2. Microarray-beelden van desample experiment 2 scherm voor gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers die discrimineren levercirrose en HCC patiënten. De microarray assay werd uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld Experiment 2 sectie. (A) Het hele slide beeld van de microarray dia uit Stap 8; (B) het schema van het antilichaam regeling binnen elke subarray; (C)-array kaarten: de locatie van elk antilichaam binnen de subarray, elk antilichaam naam staat voor 3 spots; (D) een zoom-in beeld van een subarray die werden geïncubeerd met serum monster; (E) een zoom-in beeld van een subarray die werden geïncubeerd met PBS controle.

Figuur 3. Glycaan profilering resultaten van voorbeeld experiment 1. Elke staaf grafiek vertegenwoordigen lectine bindend profiel (of glycaan profielen) van een van de 20 geteste eiwit. Totaal 22 verschillende lectines werden gebruikt om e analyserene glycosyleringsprofiel van elke proteïne.

Discussion

1. Target eiwit-en capture-antilichaam selectie

Voorafgaand aan het antilichaam microarray test sommige reagentia en materialen nodig geacht en bereid. Om een ​​antilichaam microarray voor glycaan profileren of glycan biomarker screening, een panel van antilichamen die specifiek glycoproteïne kandidaten te ontwerpen moet worden bepaald op basis van de literatuur of van eerdere resultaten. Deze antilichamen werden meestal gekocht van verschillende leveranciers, zoals R & D Systems, etc. IgGs...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ID	Naam van het serum	Afkorting	Vennootschap	Catalog #
L1	Gebiotinyleerde Concanavaline A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Gebiotinyleerd Sambucus nigra Lectin	SNA	Vector Laboratories	B-1305
L3	Gebiotinyleerd Lens Culinaris agglutinine	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Gebiotinyleerd Ricinus Communis agglutinine I	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Gebiotinyleerd Aleuria aurantia Lectin	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Gebiotinyleerd Erythrina Cristagalli Lectin	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Gebiotinyleerd Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Gebiotinyleerd Wheat Germ agglutinine	WGA	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Gebiotinyleerd Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Gebiotinyleerd Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Gebiotinyleerd Peanut agglutinine	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Gebiotinyleerd Pisum sativum agglutinine	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Gebiotinyleerd Dolichos Biflorus agglutinine	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Gebiotinyleerd Datura stramonium Lectin	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Gebiotinyleerd Sophora Japonica agglutinine	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Gebiotinyleerd Soja agglutinine	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Gebiotinyleerd Solanum tuberosum (aardappel) Lectin	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Gebiotinyleerd Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin I	GSL I	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Gebiotinyleerd Vicia villosa Lectin	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Gebiotinyleerd Lycopersicon esculentum (tomaat) Lectin	LEL	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Gebiotinyleerd Ulex europaeus agglutinine I	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Gebiotinyleerd Jacalin	JACALIN	Vector Laboratories	BK-3000
A1	Geit F (ab ') 2 Fragment anti-humaan IgM, Fc5μ antilichaam	IgM	Jackson Immuno Onderzoek	109-006-129
A2	Donkey F (ab ') 2 Frag anti-humaan IgG (H + L) eentibody	AB1	Jackson Immuno Onderzoek	709-006-149
A3	Muis anti-humaan IgG F (ab ') 2 monoklonaal antilichaam	AB3	Jackson Immuno Onderzoek	209-005-097
A4	Geit anti-humaan alpha 2 macroglobuline polyklonaal antilichaam	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Konijn anti-humaan alfa-1-antitrypsine polyklonaal antilichaam	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Muis anti-humaan alfa-1-antitrypsine monoklonaal antilichaam	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Konijn anti-humaan alfa-1-antitrypsine polyklonaal antilichaam	ACT	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	Konijn anti-humaanalpha-1-antichymotrypsine polyklonaal antilichaam	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Muis anti-humaan transferrine monoklonaal antilichaam	Transferrine	GeneTex	GTX101035
A10	Konijn anti-humaan transferrine polyklonaal antilichaam	Transferrine	GeneTex	GTX77130
A11	Geit anti-humaan apolipoproteïne J polyklonaal antilichaam	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Muis anti-humaan GP73 monoklonaal antilichaam	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Muis anti-humaan GP73 monoklonaal antilichaam	GP73	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGIE INC	sc-101275
A14	Konijn anti-humaan alfa-1 fetoprotein polyklonaal antilichaam	AFP	Genway	GWB-41C966
A15	Muis anti-humaan alpha-1-fetoproteïne monoklonaal antilichaam	AFP	Fitzgerald	10 A05A
A16	Muis anti-humaan hemopexin monoklonaal antilichaam	Hemopexin	Assaypro	60,190 tot 05.011
A17	Muis anti-humaan glypican-3 (1G12) monoklonaal antilichaam	GPLv3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Muis anti-humaan kininogen (LMW) monoklonaal antilichaam	Kininogen	Assaypro	20333 tot 05011
A19	Konijn anti-humaan MMP-21 monoklonaal antilichaam	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Muis anti-humaan CEACAM-1 monoklonaal Antibody	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Rat anti-humaan DPPIV/CD26 monoklonaal antilichaam	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Muis anti-humaan PIVKA II monoklonaal antilichaam	PIVICA	Crystal chem	8040
A23	Muis anti-carcino-embryonaal antigeen	CEA	Amerikaanse biologische	C1300
A24	Muis anti-CA125 Cancer Antigen	CA125	Amerikaanse biologische	C0050-01D
A25	Muis anti-CA19-9 kanker antigeen	CA19-9	Amerikaanse biologische	C0075-18
A26	Muis anti-Lewis x monoklonaal antilichaam	Lewis X	Calbiochem	434631
bio	Gebiotinyleerd BSA (positieve controle)	Bio	Huisgemaakte	N / A

Naam van / het reagens s apparatuur	Vennootschap	Catalogusnummer
Niet contact microarrayer	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplaat	Visser	14-230-243
Foodsaver	Foodsaver	V3835
Ultradunne nitrocellulose coate microarray schuift	Gentel	PATH
Slide Imprinter (optioneel)	De Gel Company	WSP60-1
Shaker	Visser	15-453-211
Centrifugeer	Eppendorf	5804 000.013
Slide wastafel / Slide Staining Schaal met afneembare Rack	Visser	08-812
Slide incubatiekamer / microscoopglaasje box	Visser	03-448-5
Brij 35, 30 w / v% oplossing in water	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Visser	P337-100
Natriumperjodaat (NAIO 4)	Sigma	311448
L-Glutaminezuur γ-hydrazide	Sigma	G-7257
Natriumacetaat watervrij (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Bovine Serum Albumine (BSA)	Lampire Biologische Labs	7500804
Fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) (10X)	Denville Wetenschappelijk	CP4390-48
Dylight 549 geconjugeerd NeutrAvidin	Thermo	22837
Proteaseremmer Cocktail Tabletten	Roche	4693159001
ChromPure humaan IgG, Fc-fragment	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure humaan IgG, volledige molecuul	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure muis IgG, volledige molecuul	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure muis IgG, Fc fragment	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure konijn IgG, volledige molecuul	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, hele molecuul	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray scanner	Tecan	LS Reloaded