Methodenartikel

Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie

DOI:

10.3791/3798

⸱

21 november 2012

 ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Florida , 2Department of Psychiatry, University of Florida

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale "activiteit" van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de introductie in de synaptische spleet, dopamine oefent zijn biologische eigenschappen via de pre-en post-synaptische doelstellingen 1. De dopamine signaal wordt beëindigd door diffusie 2-3, extracellulaire enzymen 4 en membraan transporters 5. De dopamine transporter, gelegen in het peri-synaptische spleet van dopamine neuronen wist de vrijgekomen aminen door middel van een naar binnen dopamine flux (opname). De dopamine transporter kan ook in omgekeerde richting om aminen vrijgeven van binnen naar buiten in een proces genaamd naar buiten vervoer of efflux van dopamine 5. . Meer dan 20 jaar geleden Sulzer et al. rapporteerden de dopamine transporter kan in twee vormen van activiteit: vooruit (opname) en achteruit (efflux) 5. De neurotransmitter model via efflux door de transporter kunt een grote hoeveelheid dopamine naar de extracellulaire ruimte, en blijkt een belangrijke regulerende rol spelen in extracellulaire dopamine homeostasis 6. Hier beschrijven we hoe gelijktijdige patch clamp en amperometrie registratie kan worden toegepast om model dopamine meten via de efflux mechanisme milliseconde tijdsresolutie wanneer de membraanpotentiaal wordt geregeld. Hiervoor zijn gehele celstroom en oxidatieve (amperometrische) signalen gelijktijdig gemeten met een Axopatch 200B versterker (Molecular Devices, een low-pass filter set Bessel bij 1000 Hz voor whole-cell huidige opname). Voor amperometrie opnemen van een koolstofvezel elektrode is verbonden met een tweede versterker (Axopatch 200B) en grenzend aan het plasmamembraan en +700 mV gehouden. De volledige cel en oxidatieve (amperometrische) stromen kunnen worden opgenomen en de stroom-spanning relatie kan worden gegenereerd met een spanningssprong protocol. In tegenstelling tot de gebruikelijke amperometrische kalibratie, die omzetting concentratie is vereist, wordt de stroom direct gerapporteerd zonder de effectieve volume 7. Aldus de verkregen datavertegenwoordigen een ondergrens aan dopamine efflux omdat sommige zender wordt verloren aan de bulk oplossing.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Apparatuur en benodigdheden

  1. Monteer een Faraday kooi bovenop de anti triltafel (TMI) om de achtergrondruis te verminderen.
  2. De gelijktijdige patch clamp amperometrie opname systeem vereist een omgekeerde microscoop met uitstekende DIC optiek en een lange werkafstand lens. Sluit de microscoop vuurtoren op een auto-accu. Deze DC lichtbron voor het systeem verdere daling van het elektrische ruis.
  3. Hydraulische micromanipulators (Siskiyou) verdere daling lawaai. In onze configuratie, gebruiken we een rechtshandige manipulator voor de hele cel opname, en de linker overhandigd voor amperometrie.

2. Bereid Elektroden voor opnemen

  1. Trek patch elektroden gebruik van kwarts pipetten op een P-2000 trekker (Sutter). Onze pull duurt ongeveer 5 sec, met twee warmte cycli. Deze warmte tijd heeft geresulteerd in een constante weerstand (3-4 MQ) in onze hele cel patch pipetten.
  2. Vul de elektrode met depipetoplossing die 2 mM dopamine en monteren op de juiste manipulator. Wikkel de container met de pipet oplossing die DA met aluminiumfolie. Blijf op ijs. Dopamine oxideerbaar. Houd de oplossing op ijs beschermd tegen licht vermindert de oxidatiesnelheid van dopamine.
  3. Verwijder een ProCFE (Dagan) een laag geluidsniveau koolstofvezel amperometrische elektrode uit de opbergdoos, vullen met kwik, mount op de amperometrische adapter (zoals afgebeeld in figuur 1), en dan monteren op de juiste maniupulator. Bescherm de tip van de koolstofvezel tegen beschadiging door die het einde van de koolstofvezel. Inspecteer de elektrode met een lab microscoop te zorgen voor de tip schoon en onbeschadigd.
  4. Onderzoek de integriteit van de amperometrische elektrode zetten de elektrode in een glazen bodem petrischaal met externe oplossing. Neem een ​​basislijn stroom in afwezigheid van dopamine. Voeg 10 ul van een 1 mM oplossing DA de schotel. Een goede amperometrische elektrode rekoorden een verhoging van de oxidatieve stroom. Herhaal deze stap aan het begin en einde van elk experiment om er zeker van de amperometrische electrode werkt.

3. Bereid de primaire neuronale Cultuur van dopamine neuronen of cellen Ontworpen om Dopamine Transporter Express in Glass Bottom Petrischalen

  1. Voorzichtig wassen de cellen of dopamine neuronen drie keer met warm externe oplossing.
  2. Monteer de glazen bodem petrischaal op de microscoop podium.

4. Visualiseer Cel-en uitvoeren Experiment

  1. Zoek de juiste brandpunt om duidelijk te visualiseren de cellen. Plaats positieve druk op de patch elektrode. Daarna voorzichtig brengen beide elektroden naar beneden in de oplossing, en dicht bij de cel.
  2. Plaats de amperometrische elektrode naast de cel (aan de linkerkant) en de patch elektrode rechts.
  3. Gigaohm bereiken een afdichting op de cel met de patch elektrode. Breuk van de afdichting met afzuiging naarbereiken gehele cel configuratie.
  4. Toestaan ​​5-8 min. voor dialyse van interne oplossing die dopamine in de cel.
  5. Gebruik de gewenste spanning stap of ramp-protocol. Gelijktijdige meten gegevens van de patch pipet en amperometrische elektrode gehele cel stromen te meten en terug transport van dopamine door de dopamine transporter terwijl de membraanpotentiaal wordt via de patch pipet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gecombineerde patch clamp met amperometrie kan meten spanningsafhankelijke DAT-gemedieerde efflux DA. Figuur 2A toont een representatieve experimentele configuratie en opnemen van DAT-gemedieerde efflux DA wanneer de intracellulaire milieu en de membraanpotentiaal worden vastgeklemd door een volledige cel patch pipet. Met deze techniek cellen die YFP-DAT eiwitten voltage-geklemd met een gehele cel patch pipet terwijl een amperometrische elektrode wordt op de plasmamembraan (Figuur 2A). ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelijktijdige voltage-clamp en amperometrie heeft de volgende voordelen. Alle celtypen zijn toegankelijk en kunnen worden gebruikt voor opname. De identificatie van de cellen of neuron waar de opnames worden gedaan, is eenvoudig en ongecompliceerd. Met name wanneer de cel fluorescent gelabelde door toevoeging van een fluorescerend label aan het eiwit van belang de experimentator kan eenvoudig de doelcel of neuron. De experimentele configuratie maakt uniforme en gecontroleerde afgifte van farmacologische middelen hetzij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr Sanika Chirwa voor kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DA026947, DA021471, en NS071122).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Uitrusting
Anti-vibratie tafel w / kooi van Faraday Technische Manufacturing Corporation 63 tot 500 serie gebruiken we het model 63 tot 543
Omgekeerde microscoop Nikon TE-2000 Nikon gestaakt nu Eclipse Ti
Twee low noise versterkers axopatch 200b Molecular Devices 800-635-5577
1-CV 203 BU headstage Molecular Devices 800-635-5578
1-HL-U pipethouder Molecular Devices 800-635-5579
Digidata 1440A A / D converter Molecular Devices 800-635-5580
Twee manipulatoren Siskyou, linksen rechtshandig Siskiyou MX6600R MX6600L 877-313-6418
Laser pipet trekker Sutter Instrumenten P-2000 888-883-0128
Laag geluidsniveau koolstofvezel amperometrische elektrode ProCFE www.dagan.com
Laag geluidsniveau kwarts pipet Sutter Instrumenten QF100-70-7.5 888-883-0128
12-volt accu van de auto schaal beschikbaar
Auto acculader schaal beschikbaar
Reagens
Natriumchloride (NaCl) Sigma S7653
HEPES Sigma H3375
Dextrose Sigma G7528
Magnesiumsulfaat (MgSO4) Sigma M2643
Kaliumfosfaat monobasisch (KH 2 PO 4) Sigma P5655
Kaliumchloride (KCl) Sigma P9333
Calciumchloridedihydraat (CaCl 2 • 2H 2 0) Sigma 223506
Magnesiumchloridehexahydraat (MgCl2 • 6H 2 0) Sigma M2670
EGTA Sigma E0396

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
  3. Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
  4. Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
  5. Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
  6. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
  7. Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
  8. Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
  9. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
  10. Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382(2010).
  11. Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Voltage clamp amperometriedopaminetransporteurrevers transportwhole cell patchkoolstofvezelelektrodeDAT gemedieerde stroomsimultane registratiecontrole van het membraanpotentieeloxidatieve stroommeting

Gerelateerde artikelen