Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Samenvatting

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van hoe Toxoplasma Egresses uit de gastheercel. Protocollen worden verstrekt aan chemisch mutageniseren parasieten, te verrijken voor mutanten met defecten in geïnduceerde uitgang en valideren het fenotype van gekloonde mutanten.

Samenvatting

De wijdverspreide, obligaat intracellulaire, protozoaire parasiet Toxoplasma gondii veroorzaakt opportunistische ziekte in immuno-gecompromitteerde patiënten en veroorzaakt aangeboren afwijkingen bij congenitale infectie. De lytische replicatiecyclus wordt gekenmerkt door drie stappen: 1. actief invasie van een kern gastheercel, 2. replicatie in de gastheercel; 3. actieve uitgang van de gastheercel. Het mechanisme van de uitgang wordt steeds meer gewaardeerd als een uniek, sterk gereguleerde proces, dat nog steeds slecht begrepen wordt op moleculair niveau. De signaalwegen die ten grondslag liggen uitgang werden gekenmerkt door het gebruik van farmacologische stoffen die op verschillende aspecten van de trajecten ^1-5. Als zodanig verschillende onafhankelijke triggers van uitgang zijn aangewezen, die allemaal samen op het vrijkomen van intracellulaire Ca ^{2 +,} een signaal dat ook is van cruciaal belang voor de gastheercel invasie ^6-8. Dit inzicht op de hoogte van een kandidaat gen aanpak die heeft geleid tot de identificatieMOETEN VOLDOEN van planten, zoals calcium, afhankelijk proteïne kinase (CDPK) betrokken bij uitgang ^9. Daarnaast hebben een aantal recente doorbraken in het begrijpen van uitgang is gemaakt met behulp van (chemische) genetische benaderingen ^10-12. Om de rijkdom van de farmacologische informatie te combineren met de toenemende genetische toegankelijkheid van Toxoplasma we onlangs een scherm mogelijk maakt de verrijking voor de parasiet mutanten met een defect in gastheercel uitgang ^13. Hoewel de chemische mutagenese met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of ethyl methaansulfonaat (EMS) is gebruikt voor tientallen jaren in de studie van Toxoplasma biologie ^11,14,15, pas onlangs heeft genetische kaart brengen van mutaties ten grondslag liggen aan de fenotypes routine ^{16 -18.} Bovendien, door het genereren van temperatuurgevoelige mutanten, kan essentiële processen worden ontleed en de onderliggende genen direct geïdentificeerd. Deze mutanten gedragen als wild-type onder de permissieve temperatuur (35 ° C), maar niet proliferate de beperkende temperatuur (40 ° C) als gevolg van de mutatie in kwestie. Hier tonen een nieuw fenotypische screening methode mutanten te isoleren met een temperatuurgevoelige uitgang fenotype ^13. De uitdaging voor uitgaand schermen is af te scheiden uit waren hadden van niet-uit waren hadden parasieten, die wordt bemoeilijkt door een snelle re-invasie en de algemene kleverigheid van de parasieten aan gastheercellen. Een eerder vastgestelde uitgaand scherm was gebaseerd op een omslachtige reeks biotinylatie stappen om intracellulair te scheiden van extracellulaire parasieten ^11. Met deze methode ook niet het genereren van voorwaardelijke mutanten wat resulteert in zwakke fenotypes. De hier beschreven methode overwint de sterke binding van egressing parasieten door er een glycan concurrent dextransulfaat (DS), die voorkomt parasieten kleven aan de gastheercel ^19. Bovendien zijn extracellulaire parasieten specifiek gedood door pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC), die intracellulaire parasieten verlaatongedeerd ^20. Daarom, met een nieuwe fenotypische scherm om specifiek parasiet mutanten te isoleren met defecten in geïnduceerde uitgang, kan de kracht van de genetica nu worden ingezet om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen gastheercel uitgang te ontrafelen.

Protocol

Overzicht

Protocollen aan eerste definiëren dosering van het mutageen leidt tot een 70% doden van parasieten (protocol 1). De volgende procedure wordt verstrekt aan de uitgang geïnduceerde mutanten verrijken van een gemutageniseerde parasiet pool (protocol 2, figuur 2). Dit wordt gevolgd door een protocol bij de incidentie van uitgang mutanten te testen in de verrijkte zwembad, of aan de uitgang fenotype in individuele mutanten (protocol 3) te valideren. Ten slotte wordt een protocol verstrekt aan een parasiet klonen genereren uit verrijkt populaties door beperkende verdunning (protocol 4).

1. Titratie van de mutagene stof

Wees extra voorzichtig, zoals dubbele handschoenen, bij het werken met zeer mutagene stoffen en vloeistoffen. Gescheiden in te zamelen vloeibaar afval voor de juiste afvoer.

1. Inoculeer T25 weefselkweekflessen samenvloeiing met de menselijke voorhuid fibroblast (HFF) cellen met 1 ml vers gelyseerd tachyzoites en groeien 18-25 uur bij 37 °; C onder _5% CO2 in ED1 medium (D-MEM aangevuld met 1% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 0,2 mM L-glutamine, 50 E / ml penicilline, 50 ug / ml streptomycine en 0,25 ug / ml amfotericine B ). Zie Roos et al.. voor de algemene groei en media van de HFF cellen en parasieten ^21.
2. Vervangen medium met 10 ml 0,1% Foetaal runderserum medium (verdund 1:10 in ED1 D-MEM) en laat in bevochtigde 37 ° C incubator onder _5% CO2 (zogenaamde "37 ° C incubator" van hier) gedurende 10 min .
3. Voeg 0, 12,5, 25, 50 of 100 ul ENU (1 M Stock in DMSO) of EMS (1 M Stock in DMSO) per vat (mutageen werkverdunningen zijn 1,25, 2,5, 5 en 10 mM, respectievelijk). Voeg DMSO 100 ul per fles. Incubeer 4 uur in een 37 ° C incubator.
4. Was driemaal 10 seconden bij kamertemperatuur door spoelen monolaag met 10 ml koud PBS (voorgekoeld bij 4 ° C).
5. Voeg 5 ml PBS, schraap de monolaag los met een rubberen spatel (cel scraper), langs de cellen geschraapt door middel van een 26,5 G naald om de parasiet fysiek te verwijderen uit de fibroblasten (clip van de as buiten de naald met zware schaar om niet bloot de naald), en het filter met 3,0 micrometer polycarbonaat filter. Meerdere naald passages zal de efficiëntie van het vrijgeven van parasieten van de gastheercel.
6. Tel de parasiet concentratie met behulp van een hemocytometer. Laat de parasieten gedurende 5 min in de hemocytomer vestigen vóór het tellen.
7. Verdun de parasieten tot 10.000 parasieten per 3 ml in ED1 (voor 10 ml 33.333 parasieten nodig zijn).
8. Goed Inoculeer een in een 6 wells plaat met 3 ml van het verdunde parasieten (met 10.000 parasieten). Serieel verwatering van de parasieten 10-voudig over 3 putten in een 6-wells plaat samenvloeiing met HFF cellen met 2,7 ml ED1 door de overdracht van 300 ul uit de eerste put. Laat platen ongestoord in de 37 ° C incubator gedurende 7 dagen.
9. Zuig medium, vast 15 min met 3 ml / putje 100% ethanol, vlekmet 3 ml / putje kristalvioletoplossing (12,5 g kristalviolet in 125 ml ethanol met 500 ml 1% ammoniumoxalaat) gedurende 15 minuten spoelen met 3 ml / putje PBS (1 minuut) en drogen. Alle bij kamertemperatuur.
10. Tel plaques en selecteer de concentratie van de mutagene stof die nodig is om overleving van 30% van de blootgestelde parasieten (70% doden van de dosering: zie figuur 1) te bereiken. Een dosering van 70% doden is historisch gezien ¹⁴ gebruikt en veroorzaakt minder dan 100 puntmutaties per genoom (Farrell, Marth, Gubbels et al.., Manuscript ingediend).

2. Verrijking van uitgaand mutanten (figuur 2)

1. Voer mutagenese zoals hierboven beschreven gebruik van een mutageen dosering het induceren van 70% doden. Grow up van de gemutageniseerde bevolking voor een passage in een nieuwe fles van gastheercellen.
2. Infecteren van een T25, HFF samenvloeiende weefselkweek kolf met 120.000 vers gelyseerd parasieten van een gemutageniseerde populatie in 10 ml ED1. Incubeer 2 uur in een 35 ° C incubator onder 5% CO2 en bevochtigd (van hieruit zogenaamde "35 ° C incubator").
3. Zuig medium en 10 seconden spoelen met 10 ml koud PBS en 10 ml ED1 medium aangevuld met 25 mg / ml dextransulfaat (DS) ^13. Incubeer 26 uur in een 40 ° C incubator onder _5% CO2 en bevochtigd (van hieruit zogenaamde "40 ° C incubator").
4. Bereid te werken oplossing van uitgang enhancers. Verdun de uitgang inductor naar keuze bij het werken concentratie in een 15 ml Falcon buis met 10 ml HBSSc aangevuld met 25 mg / ml DS. Pre-warm de verdunningen gedurende 30 minuten in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 voor het bewerken concentraties.
5. Zuig medium van de parasiet-geïnfecteerde kolven en voeg voorverwarmde egress inductor oplossing. Incubeer in het 37 ° C incubator gedurende de aangegeven tijdsduren in tabel 1.
6. Zuig medium en spoel 10 seconden met 10 ml koud PBS en voeg dan 10 ml ED1 aangevuld met 25 mg / ml DS en 50 uM pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC: add 5 pi 100 mM PDTC Stock in PBS) ^13. Incubeer 5 uur in een 35 ° C incubator.
7. Zuig medium en spoel een keer 10 seconden met 10 ml PBS (kamertemperatuur) en voeg dan 10 ml ED1 medium. Plaats kolven in de 35 ° C incubator tot parasieten te vernietigen de monolaag: dagelijks schudkolven. Dit herstel duurt ongeveer 7 dagen.

3. Validatie van de mutant fenotype door de uitgang assays

Na het uitvoeren van de verrijking scherm en het opgroeien van de bevolking verrijkt voor een passage in HFF cellen, de fenotypes moeten worden bevestigd door een uitgang assay ^11,13. Deze test moet ook worden gebruikt om enkele klonen te valideren na protocol 4.

1. Inoculeer 20.000 parasieten per well in een 24-wells plaat met samenvloeiende HFF cellen gekweekt op dekglaasjes (1 ml ED1 medium per well). Incubeer 8 uur in een 35 ° C incubator vervolgens over in een 40 ° C incubator voor 24 uur.
2. Wassen met 1 ml / putje PBS (10 seconden bij kamertemperatuur). Voeg 1 ml uitgang inductoren (voorzien van een DMSO alleen negatieve controle), pre-opgewarmd en verdund in HBSSc en incubeer gedurende de tijden beschreven in tabel 1.
3. Zuig medium en vast met 1 ml / putje werd 100% methanol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Als ouder parasieten hebben een autofluorescente eiwit werden gebruikt voor de mutagenese, ga dan naar # 3.5 stap ^13. Als niet-fluorescerend eiwit tot expressie parasieten werden gebruikt als ouderlijn, vlekken op het vaste dekglaasjes met Diff-Quick vlek 1 min bij kamertemperatuur ^11.
5. Was 5 min met 1 ml / putje PBS in 24-putjes plaat bij kamertemperatuur.
6. Voor fluorescerend eiwit tot expressie parasieten: snel Spoel de dekglaasje in DDH ₂ O (dompelen) en op dia's onder gelmount om de fluorescentie-signaal te beschermen. Voor Diff-Quick lood parasieten, was 10 seconden in 100% ethanol en laat de lucht drogen voor de montage op dia.
7. Een (fluorescentie) microscoop met een40-60x doel telt het percentage van de vacuolen uit waren hadden ten opzichte van de vacuolen dat bleef intracellulaire (zie figuur 4).

4. Kloon egress mutanten door beperkende verdunning

Na validatie van het fenotype van de verrijkte uitgang mutant bevolking met behulp van protocol 3, de polyklonale populatie moet worden gekloond om enkele parasiet klonen te verkrijgen.

1. Tel parasiet populatie in een hemocytometer en verdun tot een concentratie van 500 parasieten per ml in ED1 medium.
2. In een 384-wells plaat met daarin een confluente monolaag van HFF cellen, vervangen door het medium met 40 ul / putje van ED1 medium met behulp van een multi-channel pipet. Zoals getoond in figuur 5, kunnen vier polyklonale populaties gekloneerd per plaat als volgt: pipet 40 ul / putje verdunde mutant 1 in putten C3-C12, mutant 2 in putten C13-C22, mutant 3 in putten H3-H12 en mutant 4 in putten H13-H22 (eind volume in putten is nu 80 pi). Met behulp van een multi-channel pipet, pipet de solution en neer 5 keer, vervolgens over 40 pi de rij onder de startrij (van rij C naar D of rij H I). Verder deze 2-voudige seriële verdunningen door rij G (mutanten 1 en 2) of rij N (mutanten 3 en 4). Gooi de extra 40 pi van de laatste rij. Incubeer in een 35 ° C incubator gedurende 7-10 dagen zonder verstoring van de plaat.
3. Controleer de putjes op een omgekeerde microscoop met 10 tot 20 doel voor de aanwezigheid van enkelvoudige platen, zichtbaar "gaten" in de monolaag.
4. Kies 4 putten per mutant met een plaquette en breng de parasieten in een weefselkweek fles samenvloeiing met HFF cellen en gevuld met ED1 medium. Grow de parasieten in een 35 ° C incubator, schud de flesjes dagelijks aan de extracellulaire parasieten verspreiden. Dit duurt gewoonlijk 7 dagen.

5. Representatieve resultaten

De mutagene ENU en EMS zijn niet stabiel wanneer ze worden bewaard gedurende een lange periode van tijd. Daarom testen mutagene kracht vande voorraden is van cruciaal belang om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Typische resultaten titratie en doden curves voor ENU en EMS in figuur 1. Wordt echter aanbevolen om plaque assays uitgevoerd voor elke mutagenèse experiment na te gaan of de juiste dosis werd gebruikt. Voor het behoud van de diversiteit in de gemutageniseerde parasiet bevolking, is het belangrijk door te gaan met de uitgang mutant scherm zo snel mogelijk. Doorgaans wordt een passage van de parasieten in een nieuwe fles uitgevoerd om te laten de overlevende parasieten te herstellen voordat ze naar voren met het scherm. Moet worden bedacht dat dit te doen zal resulteren in verdeling van de mutanten. Daarom kan niet uitgesloten worden dat meerdere klonen mutanten geïsoleerd na het voltooien van de volledige procedure exact hetzelfde genotype bevatten. Om te voorkomen dat het isoleren van de dezelfde mutant meerdere keren is het aanbevolen om slechts een enkele uitgang mutant per mutagenese te isoleren, tenzij hun fenotypen (bv. differentiële uitgang inductor gevoeligheden) zijnzeer verschillend. Aan de andere kant niet elk scherm resultaten isolatie van mutanten met het gewenste fenotype. Met name de ^{Ca2 +-ionofoor} A23187 resistent fenotype is zeldzaam zijn meerdere mutagenese experimenten en schermen te isoleren een uitgang mutant. Daarom wordt aanbevolen tot 5-10 mutagenese en scherm experimenten uit te voeren in parallel.

Verrijking kracht van het scherm werd getest door het mengen van een bekende uitgang mutant met het wild-parasieten in verschillende verhoudingen. Deze mixen werden onderworpen aan het scherm en de incidentie van het mutante fenotype van de verrijkte bevolking werd beoordeeld. Door het gebruik van wild-type parasieten uiten cytoplasmatische RFP en een mutant lijn te drukken cytoplasmatisch YFP de incidentie snel kunnen worden vastgesteld door middel van flowcytometrie (figuur 3) ^13. De resultaten tonen aan dat mutant fenotypen routinematig worden verrijkt met 80% zuiverheid, te beginnen met een uitgang mutant parasiet 10.000 wild-type parasites ^13. Wanneer de uitgang mutant: wild-type parasiet start verhouding 1:100.000 parasieten de geïsoleerde populatie slechts 1-2% (1:100) uitgang mutanten. Daarom is de verrijking kracht van het scherm is 1.000-voudig. Omdat het scherm begint met enting van 120.000 parasieten, van die typisch 70% levensvatbaar zijn, hebben we meestal voeren twee ronden van verrijking. De geïsoleerde parasieten zijn opgegroeid tussen de verrijking rondes. Deze procedure leidt tot een 100% mutant bevolking ook bij het starten met 1:1.000.000 uitgang mutant: wild-type parasieten.

De uitgang test te valideren en te karakteriseren van de fenotypes is een veelvoud van gastheercel infectie die differentiatie van de individuele vacuolen mogelijk maakt. Dit is vooral van belang bij het analyseren van omstandigheden met hoge percentages van uitgang als de individuele parasieten zijn versnipperd. Zoals getoond in figuur 4 als waren hadden populaties niet goed gescheiden is het gemakkelijk te onderschatten percentagevan uitgang door het tellen twee waren hadden vacuoles als een vacuole. Aangezien de uitgang en de invasie zijn processen, en een aantal temperatuurgevoelige fenotypes vertonen een milde fenotype bij de lagere temperatuur, zullen niet alle mutanten hebben soortgelijke invasie efficiëntie. Dergelijke mutanten moet dus worden ingeënt tegen een aantal maal hogere doseringen om een ​​voldoende hoge dichtheid vacuole te verkrijgen voor een nauwkeurige beoordeling van hun uitgang fenotype. Bovendien, sommige uitgang inductoren niet efficiënt te stimuleren uitgang van vacuolen met vier parasieten of minder. Als zodanig is het belangrijk dat vacuoles acht parasieten of meer bevatten bij het starten van de uitgang assay. In ons lab hebben we het scherm mutanten geïsoleerd met een bepaalde uitgang versterker tegen andere uitgang enhancers. Door een profiel hun cross-reactiviteit van de mutanten kunnen worden ingedeeld in verschillende klassen. Ten slotte zullen niet alle uitstappen mutanten zijn temperatuurgevoelig. In het bijzonder mutanten geïsoleerd met uitgang inductoren triggering stappen voor de release van intracellular ^{Ca2 +} gevoelig zijn niet temperatuur gevoelig fenotype. Dit komt door de parallelle trajecten die kunnen leiden tot uittreden voor het signaal convergeert de vrijmaking van ^{intracellulair} Ca2 ^+.

Figuur 1. Chemische mutageen dosistitratie. A. plaque assays uitgevoerd in een 6-wells plaat met verschillende concentraties EMS en verschillende aantallen parasieten per ook aangegeven. De witte vlekken parasiet plaques gevormd in de HFF monolaag. B, C. overlevingscurven van parasieten bij blootstelling aan verschillende doseringen EMS (B) en ENU (C). Overleving werd bepaald door plaque assays. Een dosering induceren 70% gedood wordt gekozen voor mutagenèse experimenten. Gemiddelden van drie onafhankelijke experimenten + / - standaardafwijking worden weergegeven.

Figuur 2. Schematische weergave van de uitgang mutant verrijking scherm. De temperatuur wordt aangegeven op de y-as, terwijl de tijd progressie wordt vertegenwoordigd door de x-as. Green parasieten reflecteren uitgang mutant parasieten, rode parasieten reflecteren wild-type parasieten. De timing van veranderingen ondergaan en stimulering door uitgang inductor aangegeven bij de bovenkant en is aangeduid met pijlen de blauwe lijn weerspiegelt de temperatuurprofiel. Aangenomen van Eidell et al.. ^13.

Figuur 3. Typische verrijking van uitgang mutant fenotypen. Enrichment resultaten van een uitgang mutant gemengd wild-type parasieten in verschillende verhoudingen (x-as). Het percentage uitgang mutant fenotypen in de populatie gegroeid na het scherm wordt uitgezet op de y-as en werd bepaald door flow cytometrie (uitgang mutant parasieten uitgedrukt cytoplasmatische YFP wild-type parasieten uitgedrukt cytoplasmic RFP). Resultaten van drie onafhankelijke experimenten worden vertegenwoordigd door rood, blauw en groen datapunten. Aangenomen van Eidell et al.. ^13.

Figuur 4. Typische resultaten van een uitgang assay. A. Pijlen geven vier intact vacuoles met 4-8 parasieten. B. Pijlen geven vier groepen van verspreide parasieten als gevolg van vier onafhankelijke uit waren hadden vacuolen. Egress werd geïnduceerd door A23187 (B) of DMSO als een negatieve controle (A). Parasieten drukken cytoplasmatische YFP ^22.

Figuur 5. Serial verwatering voor klonale parasiet lijnen. Vier polyklonale populaties (rood, blauw, geel, groen) worden serieel verdund in een 384-wells plaat samenvloeiing met HFF cellen. Rij C en ik ontvang 10 parasieten per goed enzijn 2-voudig verdunde (40 pi + 40 pi) tot rijen H en N resp. De schaduw van grijs geeft aan het dalende aantal parasieten per putje. Meestal worden enkele klonen te vinden in rijen DF en JL.

Samenstelling	Voorraad	Werkconcentratie	il nodig T25 (10 ml)	Incubatie tijd (min)
DTT	1 M in DMSO	5 mM	50	15
ethanol	190 standaardsterkte	5%	500	30
A23187	2 mM in DMSO	1 pM	5	5
nigericin *	2 mM in DMSO	10 uM	50	30

* Nigericin kan niet worden gebruikt in de verrijkenment scherm als de parasieten niet overleven nigericin stimulatie, alleen nigericin gebruiken in de validatie van uitgang mutanten.

Tabel 1. Egress inductoren gebruikt in procedures. Verdunnen in 10 ml HBBSc met 25 mg / ml DS voor het scherm, of geen DS voor mutant validatie (egress test). Alle verbindingen van Sigma-Aldrich.

Discussie

De beschreven protocol biedt een efficiënte methode om Toxoplasma mutanten te isoleren met een uitgang defect. We hebben succes geïsoleerd mutanten langs verschillende stappen van de uitgang route, waarvan een dubbele invasie fenotype ^13. Mogelijke effecten op de invasie kan worden bepaald met behulp van de zogenaamde rood-groen-test, die zich onderscheidt van niet-inval parasieten binnengevallen door differentiële antilichaam kleuring ^23,24. Zowel invasie en uitgang assays het kan g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, bewaren bij -20 ° C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, bewaren bij -20 ° C
Dextransulfaat	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	Merck Chemicals	65044-93
Filterhouder	Cole Parmer-	540100
3 pm polycarbonaatfilter	Whatman papierSchleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Wetenschappelijk	1475
CO 2-incubatoren	Diverse fabrikanten		Bevochtigd, 5% CO2, 35, 37 en 40 ° C
Fluorescentiemicroscoop	Diverse fabrikanten		Idealiter omgekeerd, breed veld met 63x of 100x olie doel

HBSSc (volgens Black et al. ^11.)

• 98,0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalogusnummer SH30588)
• 100 pi 1 M _MgCI2 (100 mM end)
• 100 pi 1 M _CaCl2 (100 mM end)
• 2,0 ml 1 M Hepes pH 7,3 (20 mM einde)
• 84 mg _NaHCÛ3 (10 mM end)