Cholesterol efflux Assay

Samenvatting

De cholesterol test is ontworpen om de snelheid van cholesterol efflux uit gekweekte cellen en de capaciteit van plasma acceptoren cholesterol afgegeven door de cellen te accepteren kwantificeren. De test bestaat uit het etiketteren van cellen met cholesterol, evenwicht van cholesterol tussen de intracellulaire zwembaden en het vrijgeven van cholesterol aan een extracellulaire acceptor.

Samenvatting

Cholesterolgehalte van cellen moet binnen de zeer nauwe grenzen te veel ofte weinig cholesterol in een cel resulteert in ontwrichting van cellulaire membranen, apoptose en necrose ^1. Cellen kunnen de bron cholesterol uit intracellulaire synthese en uit plasma lipoproteïnen, beide bronnen voldoende zijn om volledig te voldoen aan cellen 'voor cholesterol. De processen van cholesterol synthese en opname wordt strak gereguleerd en tekortkomingen van cholesterol zijn zeldzaam ^2. Te veel cholesterol komt vaker voor probleem ^3. Met uitzondering van hepatocyten en enigszins bijnierschors, cellen niet kunnen cholesterol breken. Cellen hebben twee opties om hun cholesterol te verlagen: het cholesterol om te zetten in cholesterylesters, een optie met een beperkte capaciteit als overbelasting van cellen met cholesterylesters is ook giftig, en cholesterol efflux, een optie met potentieel onbeperkte capaciteit. Cholesterol efflux is een specIFIC proces dat wordt gereguleerd door een aantal intracellulaire vervoerders, zoals de ATP-bindende cassette transporter eiwitten A1 (ABCA1) en G1 (ABCG1) en scavenger receptor type B1. De natuurlijke acceptor van cholesterol in het plasma is high density lipoproteïne (HDL) en apolipoproteïne AI.

De cholesterol efflux test is ontworpen om de snelheid van cholesterol efflux uit gekweekte cellen te kwantificeren. Het meet het vermogen van cellen te handhaven cholesterol efflux en / of de capaciteit van plasma acceptoren cholesterol afgegeven door de cellen te accepteren. De test bestaat uit de volgende stappen. Stap 1: etiketteren van cellulaire cholesterol door het toevoegen van het label cholesterol aan serum-bevattend medium en incubatie met cellen voor 24-48 uur. Deze stap kan worden gecombineerd met het laden van cellen met cholesterol. Stap 2: incuberen van cellen in serum-vrij medium gelabelde cholesterol evenwicht tussen alle intracellulair cholesterol zwembaden. Deze fase kan worden gecombineerd met activering van cellulaire lolesterol transporteurs. Stap 3: incuberen van cellen met extracellulaire acceptor en kwantificering van beweging van gelabelde cholesterol uit cellen van de acceptor. Als cholesterolprecursors werden gebruikt om cholesterol nieuw gesynthetiseerde label, een vierde stap, zuivering van cholesterol, nodig zijn.

De test levert de volgende informatie: (i) hoe een bepaalde behandeling (een mutatie, een knock-down, een overexpressie of een behandeling) de capaciteit van de cel invloed op cholesterol efflux en (ii) hoe de capaciteit van de plasma-acceptoren te accepteren cholesterol wordt beïnvloed door een ziekte of een behandeling. Deze methode wordt vaak gebruikt in de context van cardiovasculair onderzoek, metabole en neurodegeneratieve aandoeningen, infectieziekten en reproductieve ziekten.

Protocol

1. Bereiding van ^{[3H]-cholesterol}

1. In de zuurkast, afzien van de benodigde hoeveelheid ^[3 H] cholesterol in een 1,5 ml microfugebuis (0,5 pCi (19 kBq) per putje is nodig voor een typische test).
2. Als ^[3 H]-cholesterol wordt gesuspendeerd in tolueen, droog het volledig naar beneden met N2 gas en resuspendeer met 100% ethanol tot een uiteindelijke concentratie van 1 uCi (37 kBq / ul. Vortex en meng goed.

2. Plating Cellen en etikettering Cellular Cholesterol

Dit protocol is getest met behulp van de volgende celtypes: de menselijke monocyten ^4,5, THP-1-menselijke monocyten-macrofagen ^6,7,8, RAW 264,7 murine macrofagen ^5,9,10,11, HeLa-cellen ^12, humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC), BHK-21 cellen ⁹ mens en de muis fibroblasten ^13,14 HepG2 menselijke levercarcinoom cellen ¹⁵ en in gewijzigde vorm van bloedplaatjes ^16.

1. Resuspendeer cellen en tel ze. Plaat cellen in 12-well platen met de uiteindelijke dichtheid van 0.2x10 ⁶ cellen per well in 0,9 ml compleet medium. Cellen blijft groeien en 0.8x10 ⁶ cellen per putje bereiken de tijd van de uitstroomtijden experiment. Voor cellen die geen delen, zoals gedifferentieerde THP-1-cellen, moet de zaaien dichtheid 0.8x10 ⁶ cellen per well. Bij gebruik 6 - of 24-putjes, dubbel of helft van het aantal cellen per putje respectievelijk. Het aantal putjes voldoende voor viervoud bepalingen voor elke experimentele voorwaarden.
2. Als differentiatie van THP-1-cellen vereist toevoegen PMA (eindconcentratie 0,1 ug / ml) aan de media gedurende 48-72 uur.
3. Voeg een kleine hoeveelheid van media in de microfugebuis met de ^[3 H] cholesterol.
4. Was zijden van de buis met media voor toevoeging ^[3H] cholesterol in een afzonderlijke portie volledig media (100 ul / well).
5. toevoegen medium met ^[3H] cholesterol in de putjes met cellen (eindvolume per putje 1 ml). Indien geen behandeling van cellen voordat kenmerken kunnen cellen worden uitgeplaat in ^[3H] cholesterol-bevattend medium.
6. Incubeer cellen gedurende 48 uur in celkweek incubator (37 ° C, _5% CO2).

3. Equilibreren Incubatie

1. Na 48 uur incubatie, controleer dan cellen onder de microscoop. Zorg ervoor dat ze gezond zijn en zijn op ongeveer 80% confluentie.
2. Verwijder de media die ^[3 H] cholesterol. Voorzichtig te wassen cellen met PBS. Herhaal 3 keer wassen.
3. Bereid serum-vrije media. Desgewenst activeren cellen door toevoeging LXR agonist (zoals 901317 TO bij 1-4 mmol / L) of cAMP (0,3 umol / l, voor cellen van de muis oorsprong) aan serumvrij-media.
4. Voeg 500 ul serum vrije media in elk putje.
5. Incubeer 18 uur in de celcultuur incubator (37 ° C, _5% CO2).

4. Cholesterol efflux Incubatie

1. Na 18 uur incubatie in serum-vrij medium, controleert cellen onder de microscoop. Zorg ervoor dat ze gezond zijn en de samenvloeiing (minimum 80% confluentie).
2. Bereid oplossing van cholesterol efflux acceptoren in serum-vrij medium. Voorbeelden van acceptoren zijn:
   Apolipoproteïne AI (apoA-I) (eindconcentratie 10 ug / ml)
   High density lipoproteïne (HDL) (eindconcentratie 20 pg / ml)
   Cyclodextrine (eindconcentratie 200 pg / ml)
   Plasma (eindconcentratie 1-2%)
3. Voorzichtig te wassen cellen met PBS.
4. Voeg 250 pi serum-vrij medium met acceptoren in elk putje.
5. Laat een set van de putten op de achtergrond efflux (uitstroom aan serum vrije media met NO acceptor) te bepalen
6. Incubeer cellen gedurende 2 uur in celkweek incubator (37 ° C, _5% CO2). Duur van de uitstroming incubatie kan variëren van 30 min tot 8 uur indien nodig.

5. Verwerking Samples

1. Na 2 uur incubatie check-cellen onder de microscoop.
2. Verzamel media in 1,5 ml microfugebuisje buizen. Spin bij 14.000 rpm voor 1-10 min bij kamertemperatuur om cellulaire vuil te verwijderen.
3. Breng 100 ul medium in 7 ml scintillatieflesje. Voeg 5 ml van Insta-gel Plus (PerkinElmer) en vortex mengsel. Opslaan overige monsters bij 4 ° C.
4. Plaats de platen in de vriezer voor 30 minuten. Voeg 500 ul dH ₂ O aan elke well. Controleer cellen onder microscoop dat alle cellen opgetild van de bodem van putjes. Als nog steeds aanhanger, ofwel laat platen met dH ₂ O bij 4 ° C 's nachts of schrapen putten.
5. Als alle cellen zijn gestart en pipetteer op en neer te breken cel klonten. Breng 100 pl in 7 ml scintillatieflesjes. Voeg 5 ml van Insta-gel Plus (PerkinElmer) en vortex mengsel. Bewaar de resterende platen bij 4 ° C.
6. Plaats scintillatieflesjes op scintillatieteller. Configureren teller te tellen voor ^[3 H] indpm eenheden.

6. Het analyseren van de resultaten

1. De snelheid van cholesterol efflux wordt meestal uitgedrukt als een percentage van cholesterol verplaatst van cellen naar de acceptor. De volgende formule wordt gebruikt:

2. De specifieke efflux wordt berekend als het verschil tussen de efflux in de aanwezigheid of afwezigheid van de acceptor (blanco).

7. Tijdlijn

8. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van een resultaat van een cholesterol efflux experiment wordt getoond in Fig. 1. In dit experiment THP-1 humane monocyten werden onderscheiden in macrofagen en cholesterol efflux verschillende acceptoren isgetest. Cholesterol efflux tot medium zonder acceptoren ("lege") was 0,79% en deze waarde werd als een niet-specifieke efflux en afgetrokken van andere waarden. Cholesterol efflux menselijke apoA-I (eindconcentratie 30 ug / ml) was 4,75%. Een verwijzing plasma monster werd opgenomen in dit experiment de inter-experimentele variabiliteit te controleren. Een referentiemonster kan worden gebruikt voor normalisering van de gegevens over een groot aantal experimenten, maar we vonden het verstandig om de test te herhalen als de variabiliteit hoog is. Een patiënt plasma (eindconcentratie 2%) werd getest voor en na de patiënt behandeld met medicijnen. De conclusie was dat bij deze patiënt medicatie een negatieve invloed op de capaciteit van het plasma om cholesterol efflux te ondersteunen had.

Een ander voorbeeld van een resultaat van de uitstroomtijden experiment wordt getoond in Fig. 2. In dit experiment RAW 264,7 macrofagen werden geactiveerd of niet geactiveerd door incubatie gedurende de nacht met de LXR agonist TO-901317 (eindconcentratie1 umol / l) en cholesterol efflux in dezelfde monster van humaan plasma (2%) werd getest. Geconcludeerd werd dat activering van cellulaire expressie van ABC transporters met LXR agonist het vermogen van cellen om cholesterol vrij te extracellulaire acceptor toeneemt.

Figuur 1. Cholesterol efflux van THP-1-cellen aan verschillende acceptors. Percentage cholesterol efflux (de verhouding van gelabelde cholesterol verplaatst van cellen aan de gespecificeerde acceptor) wordt na aftrek van lege waarden. Gemiddelde ± SD van bepalingen viervoud, * p <0,05.

Figuur 2. Cholesterol efflux van RAW 264,7 geactiveerd of niet geactiveerd met LXR agonist voor de menselijke plasma. Percentage van cholesterol efflux (dat wil zeggen het deel van de gelabelde cholesterol verplaatst van cellen aan degespecificeerd acceptor) is weergegeven na aftrek van lege waarden. Gemiddelde ± SD van viervoud bepalingen, * p <0,001.

Discussie

De beschreven methode om cholesterol efflux te meten is ontwikkeld om beweging van cholesterol te meten van de cellen een extracellulaire cholesterol acceptor. Er zijn verschillende kritische beschouwingen bij het begrijpen van deze methodologie.

Etikettering en evenwicht

In de beschreven methode gemerkte cholesterol wordt toegevoegd serum bevattend serum. Hoewel niet in detail onderzocht, wordt aangenomen dat cholesterol wordt opgenomen in serum lipoproteïnen en wo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia \ Cellen	HeLa	THP-1	RAW	HUVEC	BHK-21	HFF
Compleet Media	RPMI - 10% FCS - 1% L-glutamine - 0,2% Pen STREP			M199 - 5% FCS - 1% L-glutamine - 1% Pen STREP - 2% HEPES (1M) - 7% Endotheliale celgroei supplement (ECG)	DMEM - 10% FCS - 1% L-glutamine - 0,2% Pen STREP
Serum Free Media	RPMI - 1% L-glutamine - 0,2% Pen STREP			M199 - 1% L-glutamine - 1% Pen STREP - 2% HEPES (1M) - 7% endotheliale cellen groeiene supplement (ECG)	DMEM - 1% L-glutamine - 0,2% Pen STREP
Passage Methode	1 x Trypsine	Schorsing	Schrapen	1 x Trypsine
Passage Ratio	03:10	01:03		01:20	01:03	01:03
Cel activatie (optioneel)		901317 TO- - LXR-agonist - Final conc. 4 pM
Andere reagentia		forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) - Celdifferentiatie - Final conc. 0.1μg/ml