We ontwikkelden een nieuw protocol om de efficiëntie van de in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen in motorneuronen te verbeteren. De gedifferentieerde ES-cellen verworven motorische neuronen heeft, zoals blijkt uit de expressie van neuronale en motor neuron markers met behulp van immunohistochemische technieken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Direct differentiatie van embryonale stamcellen (ES cellen) in functionele motorische neuronen een veelbelovende bron van de ziekte mechanismen te bestuderen, nieuwe medicijnen verbindingen te screenen, en om nieuwe therapieën voor motor neuron ziekten zoals spinale musculaire atrofie (SMA) en amyotrofische laterale sclerose te ontwikkelen ( ALS). Veel van de huidige protocollen maken gebruik van een combinatie van retinoïnezuur (RA) en sonic hedgehog (Shh) om de muis embryonale stamcellen (MES) cellen differentiëren tot neuronen 1-4. Echter, de differentiatie efficiëntie van MES cellen in motorische neuronen alleen een ontmoeting met matig succes. We hebben een twee-staps differentiatie protocol nr. 5 die aanzienlijk de differentiatie-efficiency verbetert in vergelijking met de huidige vastgestelde protocollen. De eerste stap is om de neuralization proces te versterken door het toevoegen van Noggin en fibroblast groeifactoren (FGF). Noggin is een bot morfogenetisch proteïne (BMP) antagonist en is betrokken bij neurale inductie eenolgens het standaard model van de neurogenese en resulteert in de vorming van de voorste neurale patronen 6. FGF-signalering werkt synergetisch met Noggin in het induceren van zenuwweefsel vorming door het bevorderen van een posterior neurale identiteit 7-9. In deze stap, werden cellen MES voorbehandeld met Noggin, bFGF, en FGF-8 twee dagen differentiatie bevorderen richting neurale lijnen. De tweede stap is het induceren van motorneuron specificatie. Noggin / FGF blootgesteld MES cellen werden geïncubeerd met RA en een Shh agonist, gladgestreken agonist (SAG), nog 5 dagen om de motor neuron generatie te vergemakkelijken. Om de differentiatie van MESs volgen in motorische neuronen, hebben we gebruik gemaakt van een ES-cellijn afgeleid van een transgene muis te drukken eGFP onder de controle van de motor neuron-specifieke promoter Hb9 1. Met behulp van deze robuuste protocol, behaalden we 51 ± 0,8% van differentiatie efficiëntie (n = 3, p <0,01, Student's t-test) 5. Resultaten van immunofluorescentiekleuring toonde aan dat GFP +-cellen van de motor neuron specifieke markers, Islet-1 en choline acetyltransferase (ChAT) uit te drukken. Onze twee-staps differentiatie-protocol zorgt voor een efficiënte manier om MES-cellen differentiëren in spinale motorische neuronen.
Protocol
1. Stap 1: Muis embryonale stamcellen (MES) Cultuur van de Cel (Timing: 3 dagen)
1. Plateren primaire embryonale muis fibroblasten (PMEF)
- Coat vier 100-mm weefselkweek gerechten met gelatine voor PMEF hechting. Voeg 8 ml 0,1% gelatine-oplossing (StemCell Technologies) elke schaal en laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het teveel aan gelatine uit gerechten. Niet uitspoelen van de gerechten.
- Verdun een flacon van mitomycine C-geïnactiveerd PMEF (Millipore) dat ongeveer bevat. 5 x 10 6 cellen in 40 ml van PMEF media (zie recept in tabel 1) en de plaat op vier 100-m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De kwaliteit van de MES-cellen is de meest kritische parameter voor een efficiënte productie van motorische neuronen. MES cellen moeten worden geteeld op PMEF om spontane differentiatie te voorkomen. Toevoeging van LIF helpt om de MES-cellen in een ongedifferentieerde toestand. Als MES cellen delen elke 12-15 uur, het kweekmedium wordt snel uitgeput en moet dagelijks worden vervangen.
Efficiënte activering van de Shh traject is een kritische parameter nodig motorneuron specificatie induceren.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit manuscript is opgedragen aan de nagedachtenis van Dr Wenlan Wang overleden op 26 mei 2011. Wij danken dr. Douglas A. Kerr voor ruim het verstrekken van de HBG3 MES cellen die worden gebruikt in deze studie. Dit werk werd gefinancierd door Nemours, een subsidie (2 RR016472-10) onder de INBRE programma van het National Center for Research Resources (NCRR), en een Cobre toekennen van subsidies uit het NCRR (5 P20 RR020173-05) naar het Centrum te ondersteunen voor Pediatric Research in het Alfred I. du Pont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, USA.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | Eindconcentratie |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | NA |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | NA |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicilline / streptomycine | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| MES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | NA |
| ES Cell-gekwalificeerde FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Niet-essentiële aminozuren | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosiden | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercapto | Millipore | ES-007-E | 0,1 mM |
| Penicilline / streptomycine | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng / ml |
| Neurale Differentiatie medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | NA |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Niet-essentiële aminozuren | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1 mM |
| Inhoudsmaat | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng / ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng / ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng / ml |
| MND medium (differentiatie) | |||
| ES-Cult basismedium-A | StemCell Technologies | 5801 | NA |
| Knockout serum vervanging | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbinezuur | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicilline / streptomycine | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0,15% in d 2 H 2 O |
| Fibronectine | StemCell Technologies | 07159 | 5 pg / ml |
| Heparine | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 ug / ml in d 2 H2O |
| β-mercapto | Millipore | ES-007-E | 0,1 mM |
| Retinoïnezuur | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 pM |
| SAG | Merck Chemicals | 566660 | 1 pM |
| MND medium (Motor Neuron cultuur) | |||
| ES-Cult basismedium-A | StemCell Technologies | 5801 | NA |
| Knockout serum vervanging | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbinezuur | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicilline / streptomycine | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0,15% in d 2 H 2 O |
| Fibronectine | StemCell Technologies | 07159 | 5 pg / ml |
| Heparine | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 ug / ml in d 2 H2O |
| β-mercapto | Millipore | ES-007-E | 0,1 mM |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng / ml |
| CNTF | R & D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng / ml |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng / ml |
| NT-3 | R & D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng / ml |
NVT = niet van toepassing.
Tabel 1. PMEF en Media voor de MES celkweek of differentiatie.
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | Eindconcentratie |
|---|---|---|---|
| 0,1% Gelatine | StemCell Technologies | 07903 | NA |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0,1 mg / ml in d 2 H2O |
| Muis laminine | Millipore | CC095 | 2 pg / ml in PBS |
| 0,25% Trypsine / EDTA | StemCell Technologies | 07901 | NA |
| Accumax | Millipore | SCR006 | NA |
NVT = niet van toepassing.
Tabel 2. Reagentia voor het bekleden en dissociatie.
Referenties
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
