De ECIS / Taxi-systeem is een geautomatiseerde, real-time test die cellulaire chemotaxis meet. In deze assay cellen bewegen onder een laag van agarose om tot een doel elektrode. Cellulaire beweging wordt gemeten door het optreden van resistentie tegen wisselstroom 0.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellulaire beweging in reactie op externe prikkels is fundamenteel voor een groot aantal cellulaire processen zoals wondgenezing, ontsteking en de reactie op infectie. Een gebruikelijke methode om chemotaxis meten is Boyden kamer assay, waarin cellen en chemoaantrekkende worden gescheiden door een poreus membraan. Zoals cellen migreren door het membraan naar de chemoattractant, zij zich aan de onderzijde van het membraan of vallen in de onderliggende media en vervolgens gekleurd en visueel geteld 1. In deze werkwijze worden cellen blootgesteld aan een steile gradiënt voorbijgaande chemoaantrekkende, waarvan men denkt dat een slechte weergave van gradiënten in weefsels 2.
Een bepalingssysteem, de onder-agarose chemotaxis assay, 3, 4 maatregelen cel beweging over een vast substraat in een dunne film vormt waterige onder agarose laag. De gradiënt die zich ontwikkelt in de agarose is ondiep en wordt gedacht om een app te zijnropriate vertegenwoordiging van natuurlijk voorkomende gradiënten. Chemotaxis kan worden geëvalueerd door microscopische beeldvorming van de afgelegde afstand. Zowel de Boyden kamer test en de onder-agaroseanalyse worden meestal geconfigureerd als eindpunt assays.
De geautomatiseerde ECIS / Taxis systeem combineert de onder-agarose aanpak met elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS) 5, 6. In deze assay worden doel elektroden in elk van 8 kamers. Een grote tegenelektrode loopt door elk van de 8 kamers (figuur 2). Elke kamer is gevuld met agarose en twee putten de snede in de agarose aan weerszijden van het doel elektrode. Een goed gevuld met de test celpopulatie, terwijl de andere houder bronnen diffunderen chemoattractant (figuur 3). Stroom door het systeem kan worden gebruikt om de verandering van de weerstand die optreedt als cellen passeren het doel elektrode bepalen. Cellen op het doel electrode de weerstand van het systeem 6. Bovendien snelle fluctuaties in de weerstand die de veranderingen in de interacties van cellen met het elektrodemateriaal en wijzen lopende cellulaire vormveranderingen. De ECIS / Taxi-systeem kan meten beweging van de cel bevolking in real-time over langere tijd, maar is ook gevoelig genoeg om de komst van een enkele cel op het doel elektrode op te sporen.
Dictyostelium discoidium bekend migreren in aanwezigheid van een foliumzuur gradiënt 7, 8 en chemotactische reactie nauwkeurig kan worden gemeten door ECIS / Taxis 9. Leukocyte chemotaxis is in reactie op SDF1α en chemotaxis antagonisten ook gemeten ECIS / Taxis 10, 11. Een voorbeeld van leukocyten reactie SDF1α is weergegeven in figuur 1.
Protocol
1. ECIS / Taxis elektrode Voorbereiding
- Het goud oppervlak van de ECIS / taxi elektrode (bestaande uit 8 kamers per dia) wordt eerste gestabiliseerd door voorbehandeling met steriele 10 mM cysteine in gedeïoniseerd water (DH 2 O) gedurende 15 min bij kamertemperatuur onder steriele omstandigheden.
- Zuig het cysteine oplossing van elke elektrode kamer 3 keer spoelen met steriel dH 2 O en vervangen door 250 ul volledig medium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mM HEPES buffer).
- Sluit de elektrode array pinnen op instrument array houder contact op te nemen elektrode controle uit te voeren.
- Chambers die goed zijn aan....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Nieuwe kenmerken van de ECIS / Taxis test zijn onder meer de mogelijkheid om het verzamelen van real-time data te automatiseren als cellen reageren op chemoattractant. Hoewel de meest voorkomende toepassing van deze technologie is het cellulaire reacties te meten aan de individuele chemotactische hellingen, of om hellingen bestaan uit mengsels van chemotaxis agonisten en antagonisten van de ECIS / Taxi's benadering is ook vatbaar is voor variaties op deze configuraties die kunnen heel nuttig zijn bij de beoordelin.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
David A Knecht en Michael A Lynes hebben een patent voor de ECIS / Taxis-technologie, die zoals reeds door de Universiteit van Connecticut in licentie gegeven aan Applied Biofysica, Inc
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (ES07408 en EB00208).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| ECIS Zθ | Toegepaste Biofysica | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Toegepaste Biofysica | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Moleculaire Toepassingen | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| Hyclone Foetaal runderserum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin / streptomycine | MP Biomedicals | 1670049 | Penicilline 5000 IU / ml streptomycine 5 mg / ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M oplossing, celkweek kwaliteit |
| 14 Gauge roestvrij staal canule (2) 4 inch | Laboratorium Supply | 5-8365-1 | Blunt punt |
Referenties
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
