Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

Samenvatting

Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K ⁺ (GIRK) kanalen beschreven. De test maakt gebruik van membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen op GIRK activiteit op het kanaal te meten. Deze techniek is geschikt voor toepassing op een aantal cellijnen.

Samenvatting

G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K ⁺ (GIRK) kanalen functioneren als cellulaire mediatoren van een breed scala van hormonen en neurotransmitters en worden uitgedrukt in de hersenen, het hart, de skeletspieren en endocriene weefsel ^1,2. GIRK kanalen worden geactiveerd na de binding van liganden (neurotransmitters, hormonen, drugs, enz.) om hun plasma-membraan-gebonden, G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's). Deze binding veroorzaakt de stimulatie van G-eiwitten (G _i G en _o), dat vervolgens binden en activeren GIRK kanaal. Eenmaal geopend de GIRK kanaal maakt het mogelijk de beweging van K ⁺ uit de cel, waardoor de rust membraanpotentiaal om meer negatief. Bijgevolg GIRK kanaal activering in neuronen afneemt spontane vorming van actiepotentiaal en remt de afgifte van neurotransmittoren. In het hart, de activering van de GIRK kanaal remt pacemaker-activiteit waardoor het vertragen van de hartslag. 3. Echter, de farmacologie van deze kanalen nog grotendeels onontgonnen. Hoewel een aantal geneesmiddelen, waaronder anti-aritmische middelen, antipsychotica en antidepressiva blokkeren de GIRK kanaal, deze remming is niet selectief en komt voor bij relatief hoge concentraties van de stof ^3.

We beschrijven hier een real-time screening test voor het identificeren van nieuwe modulatoren van GIRK kanalen. In deze assay worden neuronale AtT20 cellen tot expressie GIRK kanalen geladen membraan potentiaal gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals bis-(1,3-dibutylbarbituric zuur) trimethine-oxonol [DiBAC ₄ (3)] of HLB 021-152 (figuur 1 ). De kleurstofmoleculen wordt sterk fluorescerend volgende opname in de cellen (Figuur 1). Behandelingvan de cellen met GPCR liganden stimuleert GIRK kanalen te openen. De resulterende K ⁺ efflux de cel veroorzaakt het membraan mogelijk om meer negatieve en het fluorescentiesignaal dalen (figuur 1). Zo kunnen medicijnen die K ⁺ efflux moduleren door het GIRK kanaal worden getest met behulp van een fluorescerende plaat lezer. In tegenstelling tot andere ionkanaal screeningstesten, zoals atomaire absorptiespectrometrie ⁴ of radiotracer analyse ^5, de GIRK kanaal fluorescentie biedt een snelle, real-time en goedkope screening procedure.

Protocol

1. Voorbereiding van de Cellen

1. Groei hypofyse AtT20 cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% paardenserum en handhaven culturen 37 ° C in een vochtige atmosfeer van _5% CO2.
2. Handhaving van de cultuur door een subcultuur van de cellen om de 5 tot 7 dagen met een standaard behandeling met trypsine procedure.
3. Smeer de putjes zwart, duidelijke bottom 96-wells platen met 50 ul van poly-L-lysine. Laat de putten drogen gedurende 30 min in de incubator.
4. Plaat de cellen in de 96-well platen met 200 pi media dichtheid van 30.000 cellen per putje en slaan de cellen in de incubator gedurende 3-4 dagen.
5. Gebruik een streven installatie bestaande uit een gesloten 4 liter beker verbonden met een vacuum aan een uiteinde en 200 ul pipet op het andere uiteinde aan het kweekmedium langzaam zuigen van de celmonolaag.
6. Was de cellen met 200 pi normaalzoutoplossing bufferoplossing (132 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 5 mM glucose, 5 mM HEPES, pH 7,4 met NaOH).
7. Voeg 200 ul van een bufferoplossing met de membraanpotentiaal-gevoelige kleurstof (MPD) DiBAC ₄ (3) of HLB 021-152 (5 pM) aan elk putje en incuberen van de cellen gedurende 40 min bij 37 ° C.

2. Voorbereiding van testverbindingen en Cell behandeling

1. Bereid een seriële verdunning van proefverbindingen (voorraad = 10 mM in DMSO) van een verbinding bibliotheek (in 96-well formaat) met een Versette (ThermoFisher) geautomatiseerde vloeistof handlingsysteem.
2. Verwijder de 96-wells plaat, die de AtT20 cellen, uit het incubator en laat de plaat op kamertemperatuur. Zuig de oude buffer en toegepast verse buffer oplossing met de MPD van de cellen.
3. De vloeistof behandeling toe te passen verschillende concentraties (10 nM tot 10 uM) van de proefverbindingen (2 tot 20 pi) en controle-oplossingen (0,1% DMSO) (in bufferoplossing containing van de MPD) van de 96-wells plaat met de cellen.
4. Incubeer de cellen gedurende 5 min met proefverbindingen voor de fluorescerende metingen.

3. Activering van GIRK kanalen, TL Metingen en Analyse

1. Plaats de 96-wells plaat in een Biotek Synergy2 fluorescerende plaat lezer en het verkrijgen van de fluorescerende achtergrond signaal op excitatie en emissie golflengtes van 520 en 560 nm, respectievelijk.
2. Breng de GPCR liganden (somatostatine = 200 nM of carbachol = 10 uM) of controle-oplossing (buffer alleen) (20 pi) aan de gootjes (totaal volume 220 pi =) aan de GIRK kanalen met de injector Synergy2 activeren. Verzamel gegevens wijst op 10 s intervallen van meer dan 300 s bemonstering periode bij excitatie en emissie golflengtes van 520 en 560 nm, respectievelijk.
3. Haal het tijdsverloop en de piek amplitude van de tl-verandering met behulp van Biotek Gen5 software en de gegevens exporteren naar Excel voor verdere analyse.
4. Bereken de z'-factor van de betrouwbaarheid van de bepaling bepalen. Platen voor z'-factor bepaling bevatte 2 rijen van elk van positieve (GPCR-ligand) en negatieve (buffer alleen) controles. De z'-factor is gedefinieerd als: Z '= 1 - (3σ _P + 3σ _N) / | μ _P - μ _N |, waar μ _P & μ _N zijn de middelen van de positieve en negatieve signalen, en a _P & σ _N zijn de standaarddeviaties van de positieve en negatieve signalen, respectievelijk ^6. Z'-elementen in het bereik van 0,5 tot 1,0 te geven dat de kwaliteit van de test is uitstekend ^6. Platen met z'-factoren lager dan 0,5 zijn uitgesloten van de analyse.
5. Verbindingen die het fluorescentiesignaal moduleren worden getest in de aanwezigheid van ^{Ba2 +} en tertiapin-Q naar binnen gelijkrichter K ⁺ kanaal specificiteit te bevestigen.

4. Representative resultaten

Een voorbeeld van de fluorescentiepiek gemeten met de GIRK kanaal assay in figuur 2. Toevoeging van de GPCR ligand somatostatine (200 nM) de AtT20 cellen veroorzaakten een snelle, tijdsafhankelijke afname van de HLB 021-152 fluorescentiesignaal (figuur 2). Daarentegen Bovendien controleoplossing tot een kleine momentane stijging van de fluorescentie met de tijd weer de uitgangssituatie (figuur 2). Vergelijking van piek fluorescerende waarden in 96-well platen geïnjecteerd met controle en somatostatine oplossingen een z'-elementen in het bereik van 0,5 gaf 0,7. Voor verdere kwantificering werd controleplan afgetrokken somatostatine plaat en de resulterende somatostatine-gevoelige signaal geanalyseerd (Figuur 2).

De test verschaft een werkwijze voor het identificeren van geneesmiddelen die snel GIRK kanalen moduleren. Bijvoorbeeld, geneesmiddelen die de GIRK cha remmennnel moet verminderen GPCR-ligand-gemedieerde afname van de fluorescentie door het voorkomen van K ⁺ efflux uit de cellen. Zoals getoond in figuur 3, de cellen behandeld met tertiapin-Q, een toxine die blokken GIRK kanalen ⁷ een remming van de somatostatine-gemedieerde fluorescerende verandering geproduceerd. Propafenon een anti-aritmische geneesmiddelen die blokken GIRK kanalen in het hart ⁸ ook de fluorescerende verandering (figuur 4) onderdrukt. De test kan ook nuttig voor het identificeren van de activatoren GIRK kanaal. De toepassing van ethanol (100 en 200 mM) een activator van het kanaal GIRK ^2,3 veroorzaakt geen significante verandering in het fluorescentiesignaal vergeleken met (p> 0,5) gebruikt.

Figuur 1. Experimentele ontwerp van de GIRK kanaal fluorescentie. AtT20 cellen geïncubeerd in een buffer met een membraame potentiaal gevoelige fluorescerende kleurstof (D). De kleurstofmoleculen gaan de cellen en worden fluorescerend bij binding aan intracellulaire proteïnes (boven). Binding van somatostatine (Som) zijn GPCR stimuleert G remmende eiwit (G _i), waardoor de activatie van de GIRK kanaal (onder). De daaropvolgende uitstroom van K ⁺ uit de cellen leidt het membraan mogelijk om meer negatief de kleurstofmoleculen de cellen af te sluiten. Als gevolg hiervan fluorescentiesignaal afneemt (onder).

Figuur 2. Vertegenwoordiger van HLB 021-152 fluorescerende signaal gemeten over de tijd in de AtT20 cellen tijdens toevoeging van somatostatine of controle oplossing. De verhouding van de fluorescentie-intensiteit (F / V _O) werd berekend door het signaal in de aanwezigheid (F) van somatostatine (of controle-oplossing) van de basislijn gemeten signaal vóór (F _O) addition van somatostatine (of controle oplossing). Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 5-6 putjes. Somatostatine of controle oplossing werd toegevoegd op tijdstip nul (↓). Toevoeging van de controle-oplossing veroorzaakt slechts een kleine toename van het fluorescentiesignaal. Dit resultaat van een temperatuursverandering door injectie van de oplossing.

Figuur 3. Behandeling van de cellen met AtT20 tertiapin-Q (500 nM) remt de somatostatine-gemedieerde afname in het fluorescentiesignaal door binding en blokkeren GIRK kanalen. Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 4-6 putjes. Somatostatine werd toegevoegd op tijdstip nul (↓).

Figuur 4. Behandeling van de cellen met AtT20 propafenon (20 uM) remt eveneens de somatostatine-gemedieerde afnamehet fluorescentiesignaal. Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 5-6 putjes. Somatostatine werd toegevoegd op tijdstip nul (↓).

Discussie

Terwijl de membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen zijn gebruikt om medicijnen die ionkanalen moduleren ^9,10 te identificeren, dit is het eerste verslag van hun aanvraag voor neuronale GIRK kanaal drug discovery. De GIRK kanaal fluorescentie hier gepresenteerde biedt een snelle, betrouwbare en real-time methode voor de screening van ligand-gated K ⁺ kanalen. De test kan worden aangepast voor gebruik met een groot aantal cellen inclusief geïmmortaliseerde cellijnen (HEK293, CHO, enz.)...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
DMEM	CellGro	10-013
Paardenserum	Invitrogen	16050-114
96-wells platen	Corning	3603
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Somatostatine	Sigma-Aldrich	S9129
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382
HLB 021-152	AnaSpec	89300
Versette geautomatiseerde vloeibare handler	ThermoFisher	650-01
Synergy2 fluorescerende plaat reader	Biotek
Gen5 analyse software	Biotek