Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

Samenvatting

Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid vet-stamcellen ¹.

Samenvatting

Natuurlijke polymeren door de jaren heen hebben meer belang, omdat van hun gastheer biocompatibiliteit en het vermogen om samen te werken met cellen in vitro en in vivo. Een gebied van onderzoek die belofte houdt in de regeneratieve geneeskunde is de combinatorische gebruik van nieuwe biomaterialen en stamcellen. Een fundamentele strategie op het gebied van tissue engineering is het gebruik van drie-dimensionale steiger (bijvoorbeeld gedecellulariseerde extracellulaire matrix, hydrogels, micro / nano deeltjes) voor de aansturing van de celfunctie. Deze technologie heeft zich ontwikkeld uit de ontdekking dat cellen een substraat waarop ze kunnen zich nodig hebben, vermenigvuldigen, en uiten hun gedifferentieerde cellulaire fenotype en functie ^2-3. Meer recent heeft ook vastgesteld dat de cellen niet alleen deze substraten te gebruiken voor de naleving, maar ook interactie en neem signalen uit de matrix substraat (bijvoorbeeld, extracellulaire matrix, ECM) ^4. Daarom werden de cellen en steigers een wederzijdse verbinding diedient om te controleren weefsel ontwikkeling, organisatie, en de uiteindelijke functie. Vet-afgeleide stamcellen (ASC) mesenchymale zijn, niet-hematopoëtische stamcellen aanwezig in vetweefsel dat multi-lijn differentiatie kan vertonen en dienen als een gemakkelijk toegankelijke bron van cellen (dat wil zeggen pre-vasculaire endotheel en pericyten). Onze hypothese is dat het vet-afgeleide stamcellen kunnen worden gericht op verschillende fenotypes tegelijk door gewoon co-kweken ze in dubbellagige matrices ^1. Ons laboratorium is gericht op dermale wondgenezing. Daartoe hebben we een samengestelde matrix van natuurlijke biomaterialen fibrine, collageen en chitosan kunnen nabootsen die de eigenschappen en functies van de dermale specifieke wondgenezing ECM omgeving.

Protocol

1. Isoleren Adipose-stamcellen (ASC) ^{1, 5}

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Isoleer rat perirenal en epididymis vet en wassen met een gebufferde zoutoplossing steriele Hank's (HBSS) met 1% foetaal bovine serum (FBS) zoals eerder beschreven ^5. Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Welfare Act, de uitvoerende Animal Welfare verordeningen en in overeenstemming met de beginselen van de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
2. Gehakt het weefsel en breng 1-2 g in 25 ml HBSS met 1% FBS in een 50 ml buis en centrifugeer bij 500 g gedurende 8 min bij kamertemperatuur.
3. Verzamelen de vrij zwevende vetweefsel laag en breng 125 ml erlenmeyer en behandelen met 25 ml collagenase type II (200 U / ml) in HBSS 45 min bij 37 ° C op een schudapparaat (125 rpm).
4. Verwijder voorzichtig de vloeibare fractie (onder olie en vet laag) door het pipetteren en opeenvolgend filteren door middel van een 100 - pm en 70 - um nylon mesh filter. Centrifugeer het filtraat bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zuig de supernatant en tweemaal was de pellet met 25 ml HBSS.
5. Resuspendeer de celpellet in 50 ml kweekmedium (MesenPRO RS basismedium) aangevuld met MesenPRO RS groeisupplement, antibiotica antimycotische (100 U / ml penicilline G 100 ug / mL streptomycine sulfaat en 0,25 ug / ml amfotericine B), en 2 mM L-glutamine en pipet cellen in twee T75 kolf (25 ml / kolf).
6. Cultuur de ASC in een _5% CO2-bevochtigde incubator bij 37 ° C (passage 2-4 ASC worden gebruikt voor alle experimenten).

2. Voorbereiden Chitosan microsferen (CSM)

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. CSM worden bereid door een water-in-olie emulsies proces met een ionisch gelering waarbij gebruik onze eerdere protocol ^5. Emulgeren van een waterige oplossing van chitosan (6 ml van 3% w / v chitosan in 0,5 M azijnzuur) in een 100 ml van een oliefase mengsel van sojaolie, n-octanol (1:2 v / v) en 5 % sorbitan-mono-oleaat (span 80) emulgator met overhead (1700 rpm) en magnetische roerstaaf (1000 rpm) tegelijkertijd in tegengestelde richting. Deze dubbele mengmethode zorgt ervoor dat micellen eerste gevormd voordat verknoping optreedt kan in oplossing blijven en niet om op de bodem. Bovendien is de magnetische roerstaaf helpt bij het de-aggregatie van chitosan tijdens micel vorming en rigidization.
2. Continu het mengsel Roer geroerd gedurende ongeveer 1 uur tot een stabiele water-in-olie emulsie wordt verkregen. Start ionische verknoping, met toevoeging van 1,5 ml 1% w / v kaliumhydroxide in n-octanol elke 15 min wordt 4 h (24 ml totaal)
3. Na voltooiing van de verknoping reactie langzaam decanteren de oliefase van het mengsel dat CSM toe en onmiddellijk 100 ml aceton wordt de oplossing troebel als gevolg van de smeerolie. Na 5 minuten decanteer, een extra 100 ml aceton en incubeer overnacht bij kamertemperatuur. De volgende dag, opnieuw was de kralen met aceton gedurende vijf minuten. Na het uitvoeren van deze seriële wast de oplossing helder werd moeten, indien niet verder wassen tot de olie verwijderd en de aceton oplossing helder.
4. Droog de herstelde bolletjes in een vacuümexsiccator en analyseren zonder verdere verwerking. U bepaalt de gemiddelde CSM deeltjesgrootte oppervlak milligram en de toestel kubieke volume met een deeltjesgrootte-analysator.
5. Voor de daaropvolgende experimenten, was de CSM drie keer met steriel water om de resterende zouten te verwijderen en door te wassen 's nachts met 5 ml absolute ethanol te steriliseren.

3. Het bepalen vanHet aantal vrije aminogroepen in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Bepaal het aantal vrije aminogroepen in CSM na ionische verknoping met de trinitro benzeensulfonzuur (TNBS) zuur assay van Bubnis en Ofner ^6. Incubeer 5 mg microsferen met 1 ml 0,5% TNBS oplossing in een 50 ml glazen buis gedurende 4 uur bij 40 ° C en hydrolyseren met de toevoeging van 3 ml 6N HCl bij 60 ° C gedurende 2 uur.
2. Koel de monsters tot kamertemperatuur en extraheren van de vrije TNBS door toevoeging van 5 ml gedeioniseerd water en 10 ml ethylether.
3. Verwarm een ​​5 ml aliquot van de waterfase tot 40 ° C in een waterbad gedurende 15 minuten om eventuele ether, afkoelen tot kamertemperatuur, verdampen en verdund met 15 ml water.
4. Meet de absorptie bij 345 nm met een spectrofotometer TNBS oplossing zonder chitosan als blanco en chitosan voor CSM pherstel van het totale aantal aminogroepen bepalen. Schatting van het aantal vrije aminogroepen van de CSM ten opzichte van chitosan.

4. Laden ASC in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Equilibreer 5 mg gesteriliseerd CSM's uit paragraaf 2.5 in steriele HBSS 's nachts en toe te voegen aan een 8 - um poriegrootte membraan cultuur plaat insert (24-wells plaat).
2. Nadat de CSM hebben zich op het membraan voorzichtig zuig de HBSS en voeg 300 ul groeimedium aan de binnenzijde van het inzetstuk en 700 ul van kweekmedia om de buitenzijde van het inzetstuk.
3. Hersuspenderen ASC de juiste concentratie (1 x ⁴ tot 04 oktober x 10 ⁴⁾ in 200 pi groeimedium en zaad via CSM in de petrischaal inzetstuk. Het eindvolume van medium in de cultuur inzetstuk, na het zaaien, 500 ul.
4. Incubaten ASC uitgezaaid CSM gedurende 24 uur in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.

5. Bepalen van het percentage van de ASC laden en levensvatbaarheid van de cellen in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Na de incubatie pipet de ASC-loaded CSM in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis zonder verstoring van de cellen die zijn gemigreerd naar de insert membraan.
2. Verwijder het resterende medium en voeg 250 ul vers groeimedium de buis.
3. Om elke buis, voeg 25 ul MTT (3 - [4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide] oplossing (5 mg / ml) en 4 h incuberen in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
4. Na incubatie verwijderen medium, voeg 250 ul dimethyl sulfoxide en vortex het mengsel gedurende 2-5 minuten de formazan complex oplosbaar.
5. Centrifugeer de CSM op 2700 g5 min uit de pipet supernatant en de golflengte absorptie bij 570 nm en 630 nm met een standaard plaatlezer bepalen volgens MTT fabrikant.
6. Bepaal de cel is gekoppeld met de CSM opzichte van de waarden verkregen uit gedefinieerd ASC getallen gekweekt tot een standaardcurve ontwikkelen.

6. Bereiding en karakterisering van ASC-CSM Ingebed in PEG-fibrine Gels

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Polyethyleenglycol (PEG) fibrine (PEG-fibrine) hydrogel bereid door Suggs et al. ⁷ door het oplossen van de succinimidyl glutaraat gewijzigd polyethyleen glycol (PEG, 3400 Da). Met 4 ml Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,8) en filter gesteriliseerd een 0,22 pm filter net voordat het experiment. Opgeloste PEG is alleen effectief in deze toepassing voor de eerste 3-4 uur.
2. Meng 500 &mu, l fibrinogeen voorraad (40 mg / ml in TBS, pH 7,8) en 250μl van PEG voorraad in een cultuur en een 6-wells plaat en incubeer 20 minuten in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Dit mengsel vormt een molaire concentratie verhouding van 1:10, SG-PEG-SG: fibrinogeen.
3. Breng 250 ul ASC-CSM in een concentratie van 5 mg CSM (≈ 2 x 10 ⁴ cellen) en meng met de gePEGyleerde fibrinogeenoplossing.
4. Onmiddellijk voeg 1 ml trombine voorraad (25U/mL) en snel een of twee keer fijnstampen met de pipet. Na menging trombine met de PEG-fibrinogeen onmiddellijk plaats de cel-gel mengsel in een 12-well plaat en geïncubeerd in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C gedurende 10 min om voor volledige gelering. Omdat de gelering tijd is snel, probeer dan niet en de gel oplossing te houden binnen de pipet tip voor langer dan 5 seconden. De gePEGyleerde fibrinogeen wordt gesplitst door trombine en vormt een gePEGyleerd fibrine hydrogel. Als zodanig the uiteindelijke gel product wordt aangeduid als PEG-fibrine.
5. Tweemaal wassen PEG-fibrine gels met HBSS en geïncubeerd met alfa minimaal essentieel medium (MEM-α) aangevuld met 10% FBS in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
6. Let op de migratie van cellen van CSM in de gel over een 11-daagse periode met behulp van standaard lichtmicroscopie technieken.

7. Bereiding en karakterisering van ASC-CSM Ingebed in Collageen Gels

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Mix ASC-CSM (5 mg met ≈ 2 x 10 ⁴ cellen) met type 1 collageen (7,5 mg / ml) uit rattenstaart pezen volgens de werkwijze van Bornstein ⁸ en fibrilleren nadat de pH op 6,8 met 2N NaOH.
2. Voeg de gefibrilleerde collageen ASC-CSM mengsel tot een 12-well plaat en gedurende 30 min in een _5% CO2 humidimelde incubator bij 37 ° C.
3. Na volledige fibrillatie incuberen de collageen ASC-CSM gels tot 11 dagen in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
4. Let op de migratie van cellen van CSM in de gel over een 11-daagse periode met behulp van standaard microscopische technieken.

8. Ontwikkeling van dubbellagige PEG-fibrine-(ASC-CSM)-Collageen Gel constructen

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Ontwikkeling van de bilaag construeren bereiden zowel het collageen en het PEG-fibrine gels zoals hierboven beschreven, met geringe modificaties. Kortom, aan de trekkende en co-inductie eigenschappen van een enkele bron van stamcellen met behulp van twee bioscaffolds te bestuderen, "sandwich" van de ASC-CSM tussen het collageen en de PEG-fibrine steigers met behulp van een proces van vier stappen: 1) Load ASC op CSM, 2) gegoten gefibrilleerde collageen gel en laag de ASC-CSM kralen over de collagen gel, 3) cast PEG-fibrinegel over de ASC-CSM-collageen gel en laat gel te stollen, en 4) medium toe te voegen aan goed en voeg naar cellen in vitro te bestuderen of te verwijderen inzetstuk voor in vivo toepassingen (zie figuur 1 ).
2. Bereid een 1 ml collageen type 1 (7,5 mg / ml) mengsel zoals beschreven in 7.1 zonder toevoeging ASC-CSM aan het mengsel. Plaats het mengsel in een 6-wells weefselkweekplaten element (8 urn poriegrootte) en geïncubeerd gedurende 30 min in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
3. Na volledige fibrillatie, laag over het collageen oppervlak 5 mg ASC-CSM (10, 000 cellen / mg) gesuspendeerd in kweekmedia (200 pi). Nadat de microsferen hebben zich over de gel bereiden PEG-fibrinegel zoals beschreven in 6.0 zonder toevoeging ASC-CSM aan het mengsel en de laag gePEGyleerde fibrinogeen / thrombine-oplossing via ASC-CSM-collageen lagen. Bij de opstelling PEG-fibrine gel, met 250 pi celkweekmedium in plaats van thij 250 pl medium waarin de cellen.
4. Na voltooiing incuberen de constructen voor 30 min in een _5% CO2 bevochtigde incubator volledige gelering bereiken voordat het voeden van de construct met kweekmedium.
5. Na volledige gelering, place 1 ml medium in de bovenste ruimte op de constructie en 3 mL medium in de onderkast.

9. Het maken van Stock-oplossingen

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

• Calciumchloride voorraad (40 mm): Gebruik alleen CaCl ₂ .2 H ₂ O. Los 588,4 mg _CaCl2 0,2 H ₂ O met 100 ml gedeïoniseerd water. Steriliseren met een 0,22 pm filter.
• Polyethyleenglycol: PEG is zeer reactief met zuurstof en kan geoxideerd bij blootstelling aan lucht in de ruimte. Als zodanig dient PEG worden bewaard onder stikstof _(N2) atmosfeer. Accurately wegen 32 mg in een 2-ml centrifugebuis (zorg ervoor dat de buizen te reinigen _met N2 voor gebruik) en bewaar bij -80 ° C tot aan gebruik. Los 32 mg PEG in 4 ml TBS oplossing voor gebruik.
  De volgende oplossingen moeten worden vers gemaakt voor elke experiment.
  
• TBS oplossing (pH 7,75-7,77 bij 25 ° C, pH bij 25 ° C zeer kritisch). Om 15 ml van de TBS-oplossing te bereiden, zorgvuldig te ontbinden een buffer tablet in filter-gesteriliseerd gedeïoniseerd water en aan te passen aan de gewenste pH. Bewaar de stockoplossing-voor te bereiden het vers elke keer.
• Fibrinogeen oplossing (40 mg / ml). Los fibrinogeen poeder TBS de fibrinogeenconcentratie 40 mg / ml. Overnacht opgelost met behulp van een magnetische roerder bij 4 ° C. Het is gemakkelijk om de gehele een-g hoeveelheid opgelost met de vereiste hoeveelheid TBS. De volgende dag, verwijder de fibrinogeen van 4 ° C (meestal bewolkt) en laat hette verwarmen in een waterbad tot een homogene oplossing wordt verkregen. Tenslotte filter steriliseren fibrinogeen met een 0,45 pm-filter.
• Trombine-oplossing (25 eenheden / ml): Om de trombine-oplossing te maken, weeg de benodigde hoeveelheid en los op met de voorbereide 40 mM CaCl ₂ .2 H ₂ O. Het is altijd een goede gewoonte om de hele flacon van trombine te gebruiken om de voorraad te maken. Voorbeeld: Los een fles van 5 kU trombine met 200 mM CaCl ₂ .2 H ₂ O, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.

10. Representatieve resultaten

Het algemene doel van de techniek die hier is om het potentieel van gelijktijdige matrix-gestuurde differentiatie van ASC aan te tonen in meerdere fenotypes met behulp van CSM als transportmiddel. We tonen een in vitro strategie om stamcellen te bevrijden van CSM in een dubbellagige collageen-PEG-fibrine schavot. Karakterisering van ASC ingebed in deze steiger revealed dat de ASC-loaded CSM kan worden 'ingeklemd' tussen een laag van collageen en PEG-fibrine gelijktijdig en differentieel te laten inspireren door zowel de extracellulaire omgeving te gedijen onder hun nieuwe omstandigheden. We hebben eerst kenmerkend was voor de mogelijkheid voor het modelsysteem levensvatbaarheid van de cellen en migrerende capaciteiten te behouden. Collageen ondersteunde het vermogen van ASC hun "stemness ', zoals werd aangetoond door hun expressie van Stro-1 en fibroblast-achtige morfologie (figuur 2D en 2F) te handhaven. Daarentegen PEG-geïnduceerde fibrine de ASC onderscheid naar een vasculaire fenotype, zoals blijkt uit de buisvormige structuur morfologie, de endotheelcel-specifieke expressie van von Willebrand factor (Figuur 2E en 2G) en pericyte-specifieke expressie van NG2 en platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFRβ) (gegevens niet getoond). Bovendien zijn deze waargenomen fenotypes leek in het begin van de cultuur voorkomen en hielden gedurende 11 dagen, net als demook aangetoond in figuur 3.

Tabellen en Figuren

Voordelen van dubbellaag Construct:

• De steiger alleen, zonder cellen voeren als een bioactieve scaffold.
• PEG-fibrine kan induceren stamcellen te differentiëren zonder toevoeging van groeifactoren.
• Collageen kan helpen bij het handhaven van de stamcellen fenotype van ASC.
• Een dubbellaag construct kan worden gebruikt als actieve substraat voor andere celtypen migreren en prolifereren (bijvoorbeeld endotheelcellen, fibroblast, keratinocyten gladde spiercellen, pericyten).
• Het kan gebruikt worden met harde tissue engineering steigers zoals hydroxyaptite of gedemineraliseerd been van harde en zachte weefsel te regenereren.
• Het kan worden gebruikt om een ​​multi-layered, diverse weefsel-engineering construct (zoals huid-en vaatziekten, vasculaire-epitheliale, huid-en vaatziekten-onderhuidse, enz.) te ontwikkelen.
• Het maakt gebruik van een single-cell source gelijktijdig te ontwikkelenmeercellige compartimenten.
• Het heeft het potentieel om te integreren met de gastheer weefsel omdat het van natuurlijke oorsprong.
• CSM binnen de gel constructie biedt een platform voor cellen om te migreren uit.
• Chitosan, gebruikt CSM bereiden is een bekende chemo-actieve lokmiddel.
• Het concept toegepast in deze protocol "matrix aangedreven stamceldifferentiatie" worden toegepast op andere typen stamcellen. Er is echter nader onderzoek gerechtvaardigd om de haalbaarheid van een matrix-gestuurde differentiatie te bepalen. De dubbellagige gel steiger een reservoir om de cellen te leveren in een duurzame en gecontroleerde manier.
• Na herstel kan de gels nog worden gescheiden in afzonderlijke componenten.

Figuur 1. Schematische afbeelding van de algemene doelstelling en het proces van de techniek. 1) Adipose-afgeleide stamcellen (ASC) zijn loaded op chitosan microsferen. 2) Collageen wordt vervolgens uitgegoten in een 6-wells insert, de pH op het collageen fibrilleren en het inzetstuk geplaatst in een 6-wells plaat kamer. De ASC-geladen CSM bollen worden dan gelaagd over de collageen. 3) Het gePEGyleerde fibrinogeen wordt gegoten over de collageen (ASC-CSM) en gegeleerd door toevoeging van trombine. 4) Het uiteindelijke construct dubbellaag kan dan worden verwijderd uit de kweek insert en gebruikt voor in vitro of in vivo analyse.

Figuur 2. Karakterisering van ASC gekweekt in collageen en PEG-fibrine 3D-matrices. A) fase-contrast microfoto van geïsoleerde ASC gepasseerd en in stand gehouden met behulp van routine 2-dimensionale celkweek technieken. Microfoto B, D en F tonen ASC-CSM gekweekt binnen een 3-dimensionale collageen gel; dat C, E en G Show ASC-CSM gekweekt binnen een 3-dimensionale PEG-fibrinegel, zowel op dag 12. In B en C) zijn weergegeven ASC migreren afstand van het gebied CSM in beide typen scaffold. ASC's lijken een afgeplatte, spindel-achtige morfologie in collageen (B) hebben, met behoud van hun uitdrukking van de stamcel marker Stro-1 (D; pijl). Wanneer gekweekt in PEG-fibrine ASC's vertonen meer tube-achtige structuren en gestimuleerd worden tot een dergelijke vasculaire cel markers als von Willebrand Factor (E) uit te drukken. Transmissie electronenmicroscopie toont de typische morfologie aangetoond ASC binnen elke scaffold. ASC in collageen-gel lijkt kleiner filopodia (fl) dat zich uitstrekt van het lichaam van de cel (F), terwijl ASC meestal gevormd lumenale (met het label L) structuren (G; pijl).

Figuur 3. Morfologische analyse van de ASC-CSM tussen dubbellagen van collageen en PEG-fibrine gels. ASC-CSM's werden "ingeklemd" tussen collageen en PEG-fibrine gels en onderhouden in cultuur voor 11 dagen. De linker column toont ASC migreren en prolifererende binnen de collageen matrix en lijken te nemen op een as-achtige morfologie. De rechterkolom toont ASC's migreren uit de buurt van de CSM en de vorming van buis-achtige structuren in de PEG-fibrine gel.

Discussie

ASC's zijn bekend om hun gemak van isolatie en het vermogen om onderscheid te maken in de richting van verschillende celtypes. Met de technieken beschreven in dit manuscript zijn wij in staat om de plasticiteit van ASC te benutten door het blootstellen van deze cellen om meerdere biomatrices tegelijk. Als cellen weg te migreren van hun CSM basis en voeren hun omringende extracellulaire omgeving, de cellen nemen richtsnoer van het schavot en kan zowel stand te houden "stemness" (collageen) of worden aangeze...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens / apparatuur	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175	Verbruiksartikelen
Foetaal runderserum	Hyclone	SH30071.03	Verbruiksartikelen
Collagenase type II	Sigma-Aldrich	C6685	Verbruiksartikelen
70-um Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352350	Verbruiksartikelen
100-um Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352360	Verbruiksartikelen
MesenPRO groeimedium System	Invitrogen	12746-012	Verbruiksartikelen
L-Glutamine	Gibco	25030	Verbruiksartikelen
CaCl 2 .2 H 2 O	Sigma	C8106	Verbruiksartikelen
T75 Tissue Culture Flask	BD Biosciences	137787	Verbruiksartikelen
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Verbruiksartikelen
Azijnzuur	Sigma-Aldrich	320099	Verbruiksartikelen
N-Octanol	Acros Organics	150630025	Verbruiksartikelen
Sorbitaan-mono-oleaat	Sigma-Aldrich	S6760	Verbruiksartikelen
Kalium Hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767	Verbruiksartikelen
Aceton	Fisher Scientific	L-4859	Verbruiksartikelen
Ethanol	Sigma-Aldrich	270741	Verbruiksartikelen
Trinitro benzeensulfonzuur	Sigma-Aldrich	P2297	Verbruiksartikelen
Zoutzuur	Sigma-Aldrich	320331	Verbruiksartikelen
Ethyl Ether	Sigma-Aldrich	472-484	Verbruiksartikelen
8-um Tissue Culture Plate Inserts	BD Biosciences	353097	Verbruiksartikelen
1,5-ml Reactievaatjes	Visser	05-408-129	Verbruiksartikelen
MTT Reagens	Invitrogen	M6494	Verbruiksartikelen
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Verbruiksartikelen
Qtracker Cell Labeling Kit (QTracker 655)	Molecular Probes	Q2502PMP	Verbruiksartikelen
Type 1 collageen	Travigen	3447-020-01	Verbruiksartikelen
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Verbruiksartikelen
12-well kultuurplaten	BD Biosciences	353043	Verbruiksartikelen
Fibrinogeen	Sigma	F3879	Verbruiksartikelen
Trombine	Sigma	T6884	Verbruiksartikelen
Benztriazole Afgeleide van polyethyleen	Sunbio	DE-034GS	Verbruiksartikelen
Tris-buffer Tablet (pH 7,6)	Sigma	T5030	Verbruiksartikelen
Centrifugeer	Eppendorf	5417R	Equipment
Orbital Shaker	New Brunswick Scienctific	C24	Uitrusting
Bevochtigde incubator met Air-5% CO2	Thermo Scientific	Model 370	Uitrusting
Overhead Roerder	IKA	Visc6000	Uitrusting
Magneetroerder	Corning	PC-210	Uitrusting
Vacuümexsiccator	-	-	Uitrusting
Particle Size Analyzer	Malvern	STP2000 Spraytec	Uitrusting
Water Bath	Fisher Scientific	Isotemp210	Uitrusting
Spectrofotometer	Beckman	Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrofotometer	Uitrusting
Draaikolk	Diagger	3030a	Uitrusting
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Uitrusting
Licht / fluorescentiemicroscoop	Olympus	IX71	Uitrusting
Confocale microscoop	Olympus	FV-500 laser scanning confocale microscoop	Uitrusting
Scanning Electron Microscope	Carl Zeiss microimaging	Leo 435 VP	Uitrusting
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEOL 1230	Uitrusting