Solubilisatie en Bio-vervoeging van Quantum Dots en bacteriële toxiciteit Testen door de groeicurve en Kiemgetal

Samenvatting

Nanodeeltjes zoals halfgeleidende kwantumdots (QD) kan worden fotoactiveerbare middelen maken voor anti-microbiële of anti-kanker toepassingen. Deze techniek laat zien hoe water-oplosbaar te cadmium (CdTe) QDs, vervoegen ze een antibioticum, en het uitvoeren van een bacteriële remming test op basis van groeicurven en kiemgetal.

Samenvatting

Quantum dots (QD's) zijn fluorescerende halfgeleider nanodeeltjes met de grootte-afhankelijke emissie spectra die kan worden opgewekt door een ruime keuze van golflengten. QD's hebben aangetrokken veel belangstelling voor de beeldvorming, diagnostiek en therapie door hun heldere, stabiele fluorescentie ^{1,2 3,4,5.} QD kunnen worden geconjugeerd aan een verscheidenheid van biologisch actieve moleculen binden aan bacteriën en zoogdiercellen ^6.

QD's zijn ook op grote schaal onderzocht als cytotoxische middelen voor gerichte doden van bacteriën. De opkomst van vermenigvuldigen-resistente bacteriestammen wordt steeds meer een bedreiging van de volksgezondheid, met name in het geval van Gram-negatieve pathogenen ^7. Door de bekende antimicrobiële werking van bepaalde nanomaterialen vooral Ag, zijn er honderden van studies naar de toxiciteit van nanodeeltjes bacteriën ^8. Bacteriële studies werden uitgevoerd met andere halfgeleider nanodeeltjes en, especially TiO ₂ ^9,10-11, maar ook ZnO ¹² en anderen, waaronder CuO ^13. Sommige vergelijkingen van bacteriële stammen zijn uitgevoerd in deze studies, meestal het vergelijken van een Gram-negatieve stam met een Gram positief. Met al deze deeltjes worden toxiciteitsmechanismen toegeschreven aan de oxidatie: ofwel photogeneration van reactieve zuurstofspecies (ROS) van de deeltjes of de directe afgifte van metaalionen dat oxidatieve toxiciteit kan veroorzaken. Zelfs met deze materialen, resultaten van verschillende studies variëren sterk. In sommige studies de Gram positieve test stam is naar verluidt gevoeliger dan de Gram-negatieve ^10, in andere gevallen is het tegenovergestelde ^14. Deze studies zijn goed beoordeeld ^15.

In alle nanodeeltje studies, kunnen deeltjes samenstelling, grootte, oppervlakte chemie, staal ouder / afbraak, en de golflengte, de kracht en de duur van de blootstelling aan het licht alle dramatische invloed op de resultaten. Bovendien synthesis bijproducten en oplosmiddelen worden beschouwd ^{16 17.} Hoge doorvoer screen technieken nodig kunnen nieuwe effectieve nanomedicine middelen te ontwikkelen.

CdTe QDs hebben anti-microbiële effecten alleen ¹⁸ of in combinatie met antibiotica. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat het koppelen van antibiotica om CdTe kan toxiciteit te vergroten om bacteriën te verminderen, maar de toxiciteit voor zoogdiercellen, als gevolg van verminderde productie van reactieve zuurstof soorten uit de conjugaten ^19. Hoewel het onwaarschijnlijk dat cadmium verbindingen worden goedgekeurd voor gebruik bij mensen, kunnen dergelijke preparaten gebruikt worden voor het desinfecteren of steriliseren van oppervlakken van water.

In dit protocol geven we een eenvoudige benadering van de oplosbaar CdTe QDs met mercaptopropionzuur (MPA). De QD's zijn klaar voor gebruik binnen een uur. Daarna demonstreren gekoppeld met een antimicrobieel middel.

Het tweede deel van het protocolgeeft blijk van een 96-wells bacteriële remming test met behulp van de geconjugeerde en niet-geconjugeerde QD's. De optische dichtheid wordt gelezen gedurende vele uren, waardoor de gevolgen van QD toevoeging en belichting onmiddellijk en geëvalueerd na herstel. We illustreren ook een kolonie tellen voor het kwantificeren van bacteriën overleven.

Protocol

1. QD solubilisatie

Dit is een methode geschikt voor CdTe. Dergelijke werkwijzen kunnen worden gebruikt met andere soorten QD zoals InP / ZnS ²⁰ en CdSe / ZnS ^21.

1. Een oplossing van CdTe QD in tolueen bij 15 uM (optische dichtheid = 2,5 de eerste exciton piek).
2. Overdracht 200 pi van dit bestand in een glazen flacon. Gebruik geen plastic!
3. Voeg 800 ul tolueen, 1 ml 200 mM boraatbuffer (pH 9) en 2 pi van 11,5 M mercaptopropionzuur (MPA).
4. Cap de flacon en schud krachtig het voor 30-60 seconden.
5. De waterige en organische-solvent fasen spontaan te scheiden. De waterige fase wordt de kleur van de QD worden. Om de tolueen laag te voorkomen, verwijdert u deze en gooi hem weg. Breng het waterfase in een schone flacon.
6. Zuiver de opgeloste QDs door wassen / filtreren viermaal met 500 ul, 10000 molecuulgewicht cutoff centrifuge filter. De filters dienengesponnen bij 3000 g gedurende 13 minuten. Voor ten minste de laatste twee wasbeurten, wassen met de gewenste uiteindelijke buffer.
7. Na de laatste wassing, schorsen gewassen QD in 50 mM boraatbuffer op de gewenste pH en bewaren bij 4 ° C. Zij stabiel gedurende 1-2 weken.
8. Meet de absorptie en emissie spectra om de concentratie op basis van gepubliceerde formules ²² schatten.

Representatieve resultaten: Figuur 1 een afbeelding van CdTe QD onder UV lamp belichting en emissiespectra voor en na water oplosbaar, met verwaarloosbare verandering van de dop uitwisseling. De grootte waarden de kerndiameter gemeten door elektronenmicroscopie.

2. QD Conjugatie met antibiotica

Dit deel van het protocol is van toepassing op alle negatief geladen water opgeloste nanodeeltjes, waaronder de meeste commerciële QDs, metaal deeltjes, en nog veel meer ^19.

1. Elke molecuul werkt dat eithre zelf monteert het negatief geladen opgelost QDs, of een reactieve groep kan worden geconjugeerd, zoals een primair amine. In dit voorbeeld gebruiken we polymyxine B (PMB), die positief geladen is en zelf-assembleert, zonder noodzaak voor conjugatie reagentia. Los het PMB _in H2O bij 60 pM. (Als gekozen antibiotica niet oplosbaar is in _H2O, opgelost in DMSO of ethanol bij een concentratie van 0,1-1 mM). Dit 10x oplossing (H ₂ O) of een 100x oplossing (oplosmiddel) zijn.
2. Bereken hoeveel QD oplossing die u nodig heeft voor de bacteriële toxiciteit experimenten. Voor een 96-wells plaat met 0,3 ml per putje in quadruplicates wordt 0,5 ml van 200 nM conjugaat nodig. Bereid twee buizen die 100 ul 1 uM quantum dots in 50 mM boraatbuffer.
3. Indien koppeling met een primair amine, stelt een 19 mg / ml (100 mM) oplossing van 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) in _H2O EDC in oplossing is niet stabiel, Het gebruik ervan en gooi de rest weg.
4. Voeg 50 pi van de 10x antibioticum oplossing (H ₂ O) of 5 pi van de 100x oplossing (oplosmiddel) naar de buis conjugaat. Voor PMB: CdTe conjugatie aan mol-verhouding van 30:1, voeg 50 ul van 60 uM PMB. Voeg H ₂ O of oplosmiddel om de QD enige controle buis.
5. Indien nodig voeg 1 pi van de EDC stockoplossing het conjugaat buis.
6. Breng het conjugaat volume tot 0,5 ml met de geschikte buffer (boraatbuffer of PBS, geen amine bevattende buffers zoals Tris, omdat zij EDC remmen).
7. Shield buizen tegen licht af met aluminiumfolie en plaats op een nutator of rocker gedurende 1 uur. Als aggregatie optreedt, herhaalt u de vervoeging met lagere concentraties van antibiotica. Titreer de concentratie naar boven totdat de deeltjes niet aggregaat.
8. Was de conjugaten door het passeren door middel van een geschikt filter. 10000 moleculair gewicht cutoff werkt voor de meeste antibiotica, maar niet voor eiwitten of antilichamen.
9. Afhankelijk van de molecule, kunnen verschillende methoden worden toegepast om het aantal moleculen per antibioticum QD schatten: absorptie of fluorescentiespectroscopie, gelelektroforese of Fourier transform infraroodspectroscopie (FTIR).

Representatieve resultaten. In dit voorbeeld is PMB conjugatie gekenmerkt door veranderingen in QD emissiespektrum. Figuur 2 toont het spectrum van CdTe QD met PMB toevoeging.

3. Voorbereiding van bacteriën voor 96-wells Screen; Bepaling van de antibiotica IC ₅₀

Dit geldt voor bijna elke bacteriële stam gekweekt in het geschikte medium ^18. De exacte duur van de opnames moet blijven hangt af van de bacteriële groei. In ons voorbeeld gebruiken we Escherichia coli gekweekt in lysogeny bouillon (LB) medium.

1. Om te kiezen passende QD conjugaat concentraties is het belangrijk om de kennis_IC50 van het antibioticum om geconjugeerd en als de QD alleen toxisch. Dit moet begonnen 2 dagen voor de conjugatie experiment. 'S Avonds zaad 10 ml bacteriële groei medium uit een nieuw kolonie, met behulp van de juiste steriele en bioveiligheid techniek.
2. De volgende dag 1-2 uur voor het experiment vullen ieder van de putten van een duidelijke bottom-96-wells plaat met een bijna maximale hoeveelheid groeimedium. Met behulp van een multichannel pipet, zaad elke well met 1-50 ul van bacteriële cultuur (de concentratie zal afhangen van hoe snel de specifieke stam groeit en zal moeten worden gekalibreerd door het laboratorium).
3. Zet de plaat op de plaat lezer en zet deze op elke 10 minuten gedurende 2 uur te lezen op een bepaalde golflengte (meestal 600 nm). Monitor de plaat, zodat de bacteriën groeien niet te dicht te snel.
4. Wanneer de cellen alle OD = 0.1-0.15 bereiken, verwijder de plaat van de plaat lezer en stop de opname.
5. Alone Toevoegen drugs-en QD's alleen opverschillende concentraties ten minste triplo. Gebruik een zijde van de plaat als "donker" control en een half te verlichten. Een voorgestelde inrichting wordt gegeven in Figuur 3. De concentraties moeten bestrijken een grote scala genoeg is om een ​​concentratie die de bacteriën remt heel weinig, en een die ze allemaal doodt op te nemen.
6. Bescherm de "donkere" kant van de plaat af met aluminiumfolie. Ver andere zijde van een lamp op de gewenste golflengte. We maken gebruik van een aangepaste 96-well, 440-nm lamp gemaakt van 2,4 mW LED's (figuur 4) en stralen gedurende 30-60 minuten. De zwarte platen met heldere bodem te helpen beschermen de niet-blootgestelde bacteriën van strooilicht. Een lege kolom kan ook gebruikt worden tussen de belichte en niet-blootgestelde zijde.
7. Na blootstelling aan licht, zet de plaat in de plaat lezer en opnemen van OD 600 elke 10 minuten voor 5-12 uur, afhankelijk van de groeisnelheid. Zodat de temperatuur <32 ° C indien mogelijk vermeden drogen van de culturen.
8. Zet de groeicurvenop een gewenst tijdstip tegen log [concentratie] en stelt _de IC50 van het antibioticum met de Hill vergelijking:

waar H is de Hill-coëfficiënt, y _max is het hoogste punt van de groei (bij voorkeur op een plateau), en y _min is de nul-punt, ook bij voorkeur op een plateau. Het is onwaarschijnlijk dat QD alleen zal veel toxiciteit de cellen bij de toegepaste concentraties dus een waarde niet bepaald.

Representatieve resultaten. Aan het einde van de opname periode zal duidelijk putjes geeft volledig celdood en een helling van celdichtheid moet verschijnen aan toenemende concentraties van het geneesmiddel. De bacteriën te laten S-vormige groeicurves (figuur 5 A), de ligging van het maximum plateau zal sterk afhankelijk van stam tot stam en ook afhankelijk van de temperatuur. Een bepaald tijdstip kangekozen als vertegenwoordiger en de waarden die zijn uitgezet tegen log [antibiotica] om de IC ₅₀ (Figuur 5 B). Om QD toxiciteit te evalueren, te overleven tegen log [QD] kan ook worden uitgezet, maar het bereiken van belangrijke bacteriën doden met QD's alleen is zeldzaam (Figuur 5 C).

4. Voorbereiding van bacteriën voor 96-wells-scherm met antibiotica / QDs

1. De dag voor het experiment, zaad 10 ml van de cultuur van een verse kolonie in de juiste rijk medium, met behulp van de juiste steriele en bioveiligheid techniek. De QD-antibiotica conjugaat moet worden voorbereid op deze dag, tenzij het zeer instabiel.
2. 1-2 uur voor het experiment vullen ieder van de putten van een duidelijke bottom-96-wells plaat met een bijna maximale hoeveelheid groeimedium. Een meerkanaalspipet zaad elk putje met 1-50 ul van bacteriële kweek.
3. Zet de plaat op de plaat lezer en zet deze op elke 10 minuten gedurende 2 uur te lezen op dezelfde golflengte als in deel 3.
4. Wanneer de cellen alle OD = 0.1-0.15 bereiken, verwijder de plaat van de plaat lezer en stop de opname.
5. Voeg QD conjugaten bij verschillende concentraties ten minste viervoud. Gebruik een zijde van de plaat als "donker" control en een half te verlichten. Een suggestie voor een lay-out wordt gegeven in figuur 6. Een bacterie-only control strip moeten altijd worden opgenomen in geval problemen met de cultuur, temperatuur, enz. van invloed op de groei omstandigheden. Een strook van het geneesmiddel slechts en QD alleen moeten eveneens worden opgenomen om ervoor te zorgen dat zij de controle plaat eerder heeft gedaan evenaren. De rest van de putten zijn gewijd aan conjugaten zodat goede statistische.
6. Bescherm de "donkere" kant van de plaat af met aluminiumfolie. Ver andere zijde van een lamp op de gewenste golflengte.
7. Na blootstelling aan licht, zet de plaat in de plaat lezer en opnemen van OD 600 elke 10 minuten voor 5-12 uur. Houd de temperatuur <32 ° C indien het mogelijk om dr te voorkomenying van de culturen.

Representatieve resultaten. De combinatie van QD's en antibiotica kan alleen zijn minder giftig dan antibiotica, even toxisch, of meer toxisch. Dit kan worden gekwantificeerd met de groeicurven en _IC50 metingen. Figuur 7 toont een voorbeeld van conjugaten die even toxisch als antimicrobiële alleen, en een voorbeeld van conjugaten die nog giftiger.

5. Plate Count

1. Kies een of meer bronnen van de behandelde plaat met 96 putjes die worden gebruikt voor seriële verdunningen en kolonie tellen.
2. Een verdunning van elk van de geselecteerde bacteriële monsters met PBS en zoutoplossing (0,9% NaCl). Breng 20 pl van de bacteriële en vul het met 180 ul zoutoplossing, wijzigt u de pipetpunt, mix en over te dragen 20 ul van de verdunde bacteriële oplossing voor 180 ul zoutoplossing. Herhaal 6 keer.
3. Neem 10 pi van elke verdunning en de plaat op een passende vaste media plaat. Alle 8 concentraties van een monster kan worden uitgeplaat op een 10 cm ronde petrischaaltje maar rechthoekige schotels voorkeur omdat het gemakkelijker is om dingen uitgelijnd.
4. Laat het drogen op de bank gedurende 15 minuten. dan incuberen bij de juiste temperatuur voor uw bacteriën gedurende 16 uur.
5. Tel kolonies en bereken kolonievormende eenheden (CFU) volgens (# kolonies x verdunningsfactor) / volume-plated = CFU / ml.

Figuur 8 toont een voorbeeld CFU plaat.

6. Representatieve resultaten

Figuur 1. CdTe QD's. (A) Acht preparaten CdTe QD belicht met UV wand (365 nm). (B) Absorptie en emissiespectra van vijf geselecteerde grootte voor en na water-oplosbaar. De onderbroken lijnen spectra in tolueen, de getrokken lijnen in water.

files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg "/>
Figuur 2. Spectrale en gel analyse van de QD-PMB conjugaten. Oranje-emitterende CdTe QD werden in dit voorbeeld, het effect van andere soorten QD moet worden geëvalueerd voor elk experiment. (A) Typische absorptie (grijze lijn) en emissie spectra (zwarte lijn) van de QD's voor vervoeging van PMB en de uitstoot (stippellijn) na de toevoeging van 160 molaire equivalenten van PMB. (B) Verband tussen de verhouding van PMB en de QD emissie-intensiteit (vierkantjes) en piek golflengte locatie (driehoeken).

Figuur 3. Aanbevolen plaat lay-out voor controle groeischijf. Een breed scala van PMB en QD concentraties is vertegenwoordigd. De ene helft van de plaat wordt bestraald (blauw gemarkeerd), en een identieke helft is beschermd tegen licht. Klik hiervoor grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Custom 96-LED-lamp voor een gelijkmatige plaat bestraling, met uitstraling en uit te schakelen. Een typische draagbare UV licht kan ook worden gebruikt, maar niet uniform de gehele plaat.

Figuur 5. Voorbeeld resultaten voor controle groeischijf. (A) vertegenwoordiger van de groei van bacteriën bochten met verschillende concentraties van het geneesmiddel, om van 0 te voltooien celdood. De open symbolen zijn PMB alleen met concentraties gegeven, de vaste symbolen zijn CdTe-PMB zonder bestraling, en de half-gevulde symbolen zijn CdTe-PMB met bestraling. Bestraling had geen effect op de PMB-only monsters, zodat deze bochten werden weggelaten voor de duidelijkheid. Alle PMB-CdTe conjugaten zijn 30:1 PMB: QD ratio's. (B) Standplaatsen van groeicurve waarden bij 200 min vs Inloggen [PMB] en past op Eq. (1). Om control voor de effecten van licht, wordt een curve gedaan met antibiotica alleen met 30 min van de blootstelling aan licht. (C) Bacteriële overleven op 200 min vs QD concentratie, met behulp van CdTe QD's. Sommige toxiciteit wordt gezien met blootstelling aan licht, maar te weinig om _een IC50 waarde te bepalen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 6. Aanbevolen lay-out voor conjugaat testplaat. De blauw-aandacht helft van de plaat mag worden blootgesteld aan licht, en de ongeaccentueerde helft is beschermd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 7. Voorbeeld resultaten voor conjugaat testplaat. Groeicurve waarden 200 min werden plotted en fit te Eq. (1). (A) CdTe-PMB conjugaten vertonen verhoogde toxiciteit meer dan PMB alleen. (B) gouden nanodeeltjes Au-PMB conjugaten tonen geen verhoogde toxiciteit meer dan PMB alleen.

Figuur 8. Voorbeeld van een CFU plaat. E. coli geënt in een 96-wells plaat werd behandeld met QD-PMB met of zonder bestraling gedurende 30 minuten. vervolgens geïncubeerd bij 32 ° C gedurende 4 uur. Seriële verdunningen van elke bacteriële monster gemaakt met zoutoplossing en 10 pi van 100 X 10 ⁷ X verdunningen uitgeplaat op agarplaten. De platen werden geïncubeerd bij 37 ° C en kolonies werden geteld na 16 uur. De plaat toont de verdunningen langs de rijen aangegeven, de kolommen: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe (B) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 pM PMB + 6,7 nM CdTe (D) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe bestraald, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe bestraald, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe bestradiated.

Discussie

Nanodeeltjes vertegenwoordigen een veelbelovende benadering om de schepping van nieuwe antimicrobiële middelen. Groeicurve-analyse is een manier om de bacteriële cel dichtheid die actief-groeiende cellen van de groei-geremd cellen onderscheidt te controleren. In combinatie met plaat telt, het zorgt voor een grondige analyse van het antibioticum potentieel van een conjugaat. De 96-well formaat maakt relatief high-throughput variaties van concentratie en andere aandoeningen, zoals blootstelling aan licht, de laatste is cr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Boraatbuffer Component # 1	Visser	Boorzuur A-74-1
Boraatbuffer Component # 2	Sigma-Aldrich	Natriumtetraboraat B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	Diverse MWCO beschikbaar
Glazen flacons	Visser	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
Polymyxine B	Sigma-Aldrich	P1004
Bacteriële growth medium (LB) Component # 1	Visser	NaCl S271
Bacteriële groei medium (LB) Component # 2	BD	Trypton 211705
Bacteriële groei medium (LB) Component # 3	BD	Gist Extract 211929
Lamp voor blootstelling aan licht	Gewoonte
Clear-bottom 96-well platen	Visser	07-200-567 of 07-200-730
Fluorescentie spectrometer	Molecular Devices
Absorptie plaat reader	Molecular Devices
BactoAgar voor vaste media	Bioshop	AGR001.1
Petrischaaltjes rond	Visser	08-75-12
Petrischalen rechthoekige	Visser	08 tot 757-11A